实验四DNA浓度测定及酶切

1、实验三、实验三、DNA浓度测定及酶切浓度测定及酶切1、学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度和纯度的原理和方法2、学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度的方法3、学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。一、实验目的一、实验目的l DNA的吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 g/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内

2、含杂质较多，可能影响酶切反应。l 目前已发现I型、II型和III三类不同的限制性内切酶，其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。限制性内切酶Hind III识别的碱基序列为：l 酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37，也有个别要求在50 65。二、实验原理二、实验原理不同核酸样品在不同核酸样品在OD260=1

3、时的浓度时的浓度1、OD260：估算核算浓度：估算核算浓度2、 OD280：估算核算浓度：估算核算浓度3、 OD260：估算核算浓度：估算核算浓度4、 OD260：估算核算浓度：估算核算浓度OD（optical density，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。不同核酸样品在不同核酸样品在OD260=1时的浓度时的浓度1、ds DNA = 50 g/ml (ng/ l )2、 ss DNA = 37 g/ml3、 RNA = 40 g/ml4、 oligo = 30 g/mlOD（optical density，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。三、实验三、实验材料材料（上次实验提取的质粒上次

4、实验提取的质粒 pSK和和MP3MP3）四、仪器设备四、仪器设备五、实验用具五、实验用具Eppendorf分光光度检测仪NanoDrop分光光度检测仪电泳仪 微型电泳槽 BioRad凝胶成像仪 紫外透射检测仪 恒温培养箱 冰盒 微量离心管 移液移液器器微量离心管（1.5 ml1） 吸管头若干 点样板NanoDrop分光光度检测仪分光光度检测仪NanoDrop测定结果测定结果DNA样品样品纯度好纯度好DNA样品样品纯度差纯度差DNA样品样品纯度差纯度差比色皿比色皿Eppendorf分光光度检测仪分光光度检测仪六、试剂六、试剂琼脂糖5TBE电泳缓冲液 10 载样缓冲液 （loading buffe

5、r） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III已知系列浓度的DNA（线性DNA分子，长约50 kb） (10、20、50、100 ng/ l )七、实验步骤七、实验步骤（一（一）分光光度计法测定）分光光度计法测定DNA的浓度和纯度的浓度和纯度（二（二）琼脂糖凝胶电泳法检测琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度（浓度（1 % agarose gel）（三（三）质粒质粒DNA的小量酶切的小量酶切（四）酶切质粒（四）酶切质粒DNA的电泳（的电泳（1.5% agarose gel）（五）（五）MP3质粒的大量酶切质粒的大量酶切1、Epp

6、endorf分光光度检测仪：取质粒DNA 2 l （约100-200 ng）至一干净的离心管，加入198 l蒸馏水稀释，充分混匀。先加200 l 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉蒸馏水，加入200 l已稀释的DNA溶液，测定260 nm及280 nm的光吸收值（OD260及OD280），计算DNA浓度、OD260/OD280（估计核酸纯度）及OD260/OD230 （估计去盐程度）比值。（自配溶液提取的质粒（自配溶液提取的质粒DNA）2、 NanoDrop分光光度检测仪：先加1 l 蒸馏水进行紫外光空白测定，然后用滤纸吸掉蒸馏水，加入1 l Elute溶液，测定上述数值。（制剂盒提

7、取的质粒（制剂盒提取的质粒DNA）（一（一）分光光度计法测定分光光度计法测定DNA的浓度和纯度的浓度和纯度 1、利用ddH2O将质粒DNA稀释到浓度为10-100 ng/ l之间，然后分别取稀释的DNA样品和已知浓度的DNA各1 l于点样板小孔中，再加入8 l TE和1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5 l Marker作为分子量标准。2、打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约半个小时后即可观察。3、将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，

8、对比已知浓度的DNA条带的粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（二）（二）琼脂糖凝胶电泳法检测琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度（浓度（1 % agarose gel） （三）（三）质粒质粒DNA的小量酶切的小量酶切20 l反应体系（反应体系（1.5 ml离心管）：离心管）： 质粒质粒DNA（pSK、MP3） 35 l（0.5-1 g） 酶切酶切Buffer 2.0 l Hind III酶酶 1.0 l 灭菌灭菌ddH2O to 20 l加样顺序：加样顺序：水、水、buffer、DNA、酶、酶 37恒温箱恒

9、温箱中放置数小时或者酶切过夜中放置数小时或者酶切过夜 1、配制、配制1.5%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶2、酶切的、酶切的DNA中加入中加入2 l的的10loading buffer，混匀后取，混匀后取20 l上样，同时点未酶切质粒上样，同时点未酶切质粒DNA（50-100 ng）进行迁移率对）进行迁移率对比，取比，取5 l Marker点样点样作为分子量标准。作为分子量标准。3、电泳结束后分析酶切后质粒条带的变化、迁移率和不同条、电泳结束后分析酶切后质粒条带的变化、迁移率和不同条带之间的亮度差异；带之间的亮度差异；同时根据已知分子量的标准同时根据已知分子量的标准DNA，通，通过线性过线性DNA条

10、带的相对位置初步估计样品的分子量。条带的相对位置初步估计样品的分子量。（三）酶切质粒（三）酶切质粒DNA的电泳的电泳（四）（四） MP3质粒的大量酶切质粒的大量酶切100 l反应体系（反应体系（1.5 ml离心管）：离心管）： MP3质粒质粒DNA 2-4 g（试剂盒抽提）（试剂盒抽提） 酶切酶切Buffer 10 l Hind III酶酶 2-4 l 灭菌灭菌ddH2O up to 100 l加样顺序：加样顺序：水、水、buffer、DNA、酶、酶 37恒温箱恒温箱酶切过夜酶切过夜 MP3和和pSK（+）质粒）质粒DNA的的Hind III酶切结果酶切结果MP3和和pSK（+）质粒）质粒DN

11、A的的Hind III酶切结果酶切结果2， 完成检测后合上滑盖，关闭电源。完成检测后合上滑盖，关闭电源。 分光光度计法测定大肠杆菌液体培养物的分光光度计法测定大肠杆菌液体培养物的OD600值值细菌细菌OD的测定原理是细菌颗粒的遮光，可以用来检测细胞数量，而通过数量能反映的测定原理是细菌颗粒的遮光，可以用来检测细胞数量，而通过数量能反映出细胞生长的状态。菌液浓度太高，用培养基稀释可以降低出细胞生长的状态。菌液浓度太高，用培养基稀释可以降低OD值，但是太高浓度值，但是太高浓度OD值的菌液可能细菌的生长状态不符合要求，比如死的菌体会比较多等。值的菌液可能细菌的生长状态不符合要求，比如死的菌体会比较多

12、等。1、在使用分光光度计时，测得的、在使用分光光度计时，测得的OD值在值在0 .1-0.4这个区间内最可靠，最好不要超过这个区间内最可靠，最好不要超过1.0。因此。因此OD尽量控制在尽量控制在0.1-1之间，最多不要超过之间，最多不要超过2.0。取值的时候要连续读数，。取值的时候要连续读数，重复重复3次的数最好。次的数最好。2、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一致。致。3、OD与体积或者说稀释倍数不一定成正比，如果与体积或者说稀释倍数不一定成正比，如果OD大于大于2.0，一般要稀释后再测

13、，一般要稀释后再测，而不能根据之前的检测结果稀释，因为而不能根据之前的检测结果稀释，因为OD太大了就会超过检测范围，灵敏度显著太大了就会超过检测范围，灵敏度显著降低。降低。4、OD值是透光率，跟体积没关系，只跟菌浓度有关系，而且只有在一定的吸光值范值是透光率，跟体积没关系，只跟菌浓度有关系，而且只有在一定的吸光值范围内成线性关系，一般在围内成线性关系，一般在0.1-1.0范围内。范围内。双酶切时不要选择识别位点有部分重叠双酶切时不要选择识别位点有部分重叠或者太靠近的酶！或者太靠近的酶！M13F：5- gTAAAACgACggCCAgTg-3M13R：5-ggAAACAgCTATgACCATg-

14、3载体单酶切：载体单酶切：酶切后需要进行脱磷，防止载体自连，而且连接后外源片段插入的方向不能固定，只能通过酶切检测或者测序判断。载体双酶切：载体双酶切：外源片段插入的方向是固定的，由目的片段两侧的酶切位点（往往通过PCR引物加入的酶切位点所确定，但要注意选择的两种酶在多克隆位点里有一定的距离，最好识别位点不要相互重叠，否则会造成酶切困难。载体单酶切和双酶切的注意事项载体单酶切和双酶切的注意事项Not I：GCGGCCGC Xba I：TCTAGA Spe I：ACTAGT CGCCGGCG AGATCT TGATCANot I：GCGGCCGC Xba I：TCTAGA Spe I：ACTAG

15、T CGCCGGCG AGATCT TGATCACleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)Base Pairs from End refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut.外

16、源片段克隆到载体里的策略和步骤外源片段克隆到载体里的策略和步骤1、根据实验目的选择合适的载体；2、分析外源目的片段的酶切位点（找absent site，分析软件：如DNAstar；网上分析程序： 如http:/www.bio- ），选择载体多克隆位点有而目的片段没有的酶切位点添加在PCR引物5末端；3、PCR引物添加的酶切位点的5端应该添加足够的添加保护碱基；4、载体酶切后一定要切胶回收；目的片段PCR扩增后切胶回收，然后酶切，酶切产物可以切胶回收，也可以直接乙醇沉淀或者利用试剂盒进行过柱纯化回收。Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)1、用紫外分光光度法测DNA含量时，对纯度不高的DNA测定结果往往不准确（偏高），且测定所用DNA量较多。用琼脂糖凝胶法电泳（与已知浓度的DNA标准系列对照）定量更为可靠。2、酶切的DNA应具备一定的纯度，其中不能含迹量的酚、氯仿、SDS等。3、反应总体积中甘油的浓度要小于5，即内切酶的体积应小于10%反应总体积（购来的酶含50甘油）。4、内切酶从-20冰箱取出后，应放入冰浴中，在其它试剂加完后最后加。每次取酶必须使用新的