野生型大肠癌发生与MAPK

1、二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。关于大肠癌的发生，长期以来认为有两种学说，即：adenoma-carcinoma-sequence学说(先有良性腺瘤，之后一部发生癌变)和de novo学说(直接从正常粘膜发生癌变)。Vogelstein于1988年对正常组织·腺瘤·癌组织进行了详细解析，完成了adenoma-carcinoma-sequence(polyp-carcinoma s

2、equence)的多阶段发癌模型，即：在小的腺瘤阶段C-myc发生异常，随着腺瘤增大K-ras基因出现点突变及P53，DCC等基因异常使肿瘤的一部分发生癌变。这一机制基本清楚。而de novo型发癌机制还不清楚。日本学者藤盛孝博教授(申请者的指导教授)的分子生物学实验结果揭示，在de novo型发癌过程中，K-ras基因基本不参与，此型癌的发生可能是由K-ras以外的其他未知的癌基因参与所致。Ras基因作为人类大肠癌发癌的重要基因被广泛研究。现已发现，K-ras基因的突变(K-ras活性型)在人大肠癌的检出率为40-50%4，5，而其余50-60%的不伴有K-ras基因点突变(K-ras野生型

3、)大肠癌(其中一部为de novo型发癌者)的发生被认为是由K-ras基因以外的未知癌基因所致。研究证明，Ras基因作为细胞增殖与分化的信号传导启动子起重要作用。它的靶蛋白有Raf、MEKK及P2-3激酶等。其中，古典的MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号传导系(RasRaf-1MEKMAPK)在细胞增殖，分化及发癌过程中起重要作用。它们具有传导上位特异的激酶依次磷酸化和激活下位特异激酶的特性。即：Ras活性型激活Raf(MAPKKK),Raf激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK。然后，由小分子的MAPK将信息转入细胞核内，引起细胞核内染色体

4、改变。因此，MAPK的活性可能在细胞质和细胞核的信号传递中起到一个连接作用。新近的研究提示“MAPK的活性异常可能与发癌有关6，7。一些纤维母细胞株的实验结果提示，作为MAPK的新家族成员的JNK(c-Jun·N-terminal Kinase)信号传导系也受Ras活化的影响，可能参与Ras活性型细胞癌变8。9。近年的研究虽然提示MAPK，JNK参与了细胞癌变，但人大肠癌与K-ras·Raf-1·MEK·MAPK以及与JNK传导系间关系尚不清楚10。11。12，13，14。尤其是K-ras野生型及K-ras活性型大肠癌与MAPK及JNK信号传导系间关系方

5、面的研究尚未见报道。倘若在大肠癌中(尤其在K-ras野生型)发现有MAPK或JNK等蛋白激酶信号传导异常(蛋白过表达，磷酸化或发现其点突变)，将会对阐明大肠癌的发生机制，特别是为探讨K-ras野生型大肠癌、de novo型癌发生机制提供有力依据。此乃本项目的主要意义所在。近来研究还表明大肠癌的K-ras codon13点突变与大肠癌预后有关5。就是说K-ras基因变异可能是判定大肠癌预后一个重要指标。在我们最近的实验中，不论在大肠癌细胞株，还是在大肠癌组织内均发现了MAPK的活性。有趣的是，K-ras Codon13有突变的大肠癌组织及细胞株内MAPK活性均低于正常组织。这些都提示此类型大肠癌

6、的癌变可能是通过不同于Ras/MAPK途径的其它方式(JNK?)发生的；与K-ras有关的MAPK及JNK信号传导蛋白激酶可能参与了大肠癌的发生，可能会对大肠癌的分期、病理类型、转移和预后的判定提供分子生物学依据，对这些问题的探讨也是本研究的目的和意义之一。3-1对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。1. Vogelstein.B.,Fearon,E.R,.Bos,J.L. Genetic alteration during colorectal-tumor development.

7、New Engl.J.Med,1988,319:525-523.2. Fearon ER,Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell,1990,61:759- 767.3. Bedenne.L.Faivre,J.Hillon,P. Adenoma-carcinoma sequence or “de novo” carcinogenesis? Cancer,1992,69:883-888. 4. Takahiro Fujimori,Kazuhiro satonaka,Sakan Maeda. Non-invol

8、vement of ras mutations in flat colorectal adenomas and carcinomas . Int. J. Caner ,1994,57:51-55. Bo,J.L.,Fearon,E.R.,Hamiton,S.R. Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature,1987,327:293-297.6. Forrester,K.,Almoguera,C.,Han,K. Detection of high incidence of K-ras oncogenes

9、 during human colon tumorigenesis. Nature,1987,327:298-303. 7. Sally C.,Hugh,P.,Christopher J.M. Activation of MAP Kinase Kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell, 1994,77:841- 852.8. 胡长灯 戚晓东 片冈澈. Effect of phosphorylation on activiti

10、es of RaplA to interact with Raf-1 and to suppress Ras-dependent Raf-1 activation. J. BioChem. 1999，274(1)：48-51. 9. Heiner.S.,Jie ZH.,Friedeirke G. Pituitary adenylate-cyclase-activating Polypeptide stimulates proto-oncogene expression and activates the AP-1 (c-Fos/c-Jun) transcription factor in AR

11、4-2J pancreatic carcinoma cells. Eur.J.Biochem,1996,242:467-476. 10. Randall,S.F.,Kathleen,M.M. Involvement of Extracellular signal-regulated Kinase2 and stress-activated protein Kinase / Jun N-terminal Kinase Activation by Transforming Growth Factor in the Negative Growth control of Breast cancer c

12、ells. Cancer Research, 1997,57:628- 633.11. Hiroya Oka,Yuji. Chatani,Osamu Yoshida, Constitutive Activation of Mitogen-activated- Protein (MAP) Kinases in Human Renal cell carcinoma. Cancer Research, 1995,55:4182-41812. Mariko Ohmori, Senji Shirasawa. Activated Ki-ras/stress-activated protein Kinase

13、 or Extracellular signal-regulated Kinase Activation in Human Colon Cancer cells. Cancer Research. 1997,57:4714-4717.13. Yasushi Kuno,Ken Konso .Tumor-specific activation of mitogen-activated protein kinase in human colorectal and gastric carcinoma tissues. Jpn. J. Cancer Res,1998,89:903-909.14. MiK

14、i H.Yamada H.Mitamura,K. Involvement of P38 MAP Kinase in apoptotic and proliferative alteration in human colorectal cancers. Anticancer Research 19(6B):5283-91,1999 Nov-Dec.15. Anthony J.Senagore,Jennifer Thebo Biener. A newly identified pattern of K-ras mutations at codons 12 and 13 is associated

15、with long-term survival in colorectal cancer. Surgery 1997,122:765-770. 三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：1)研究MAPK、JNK等信号传导系蛋白激酶的活性与K-ras野生型(K-rasWT)及K-ras活性型人类大肠癌发生的关系，探讨人大肠癌发生机制；尤其要阐明K-ras野生型大肠癌的发生机制，为研讨de novo型大肠癌发生机制提供分子生物学依据。2)比较和探讨MAPK、JNK等信号传导系蛋白激酶的活性及K-ras的变异与大肠癌的临床病理特征(病期、类型、浸润、转移及预后)的相关关系，为临床

16、诊疗及预后判定提供分子生物学依据。研究内容：本实验通过分子生物学手段将人大肠癌(组织及细胞株)分为K-ras野生型和K-ras活性型；用特异抗体(western blot法)测定和比较两型大肠癌的MAPK及JNK信号传导系各蛋白激酶的活性，从而探讨K-ras及MAPK·JNK信号传导系与大肠癌发生及临床病理特征的关系。一、 人大肠癌的K-ras基因的分类(野生型和活性型)及分布的研究。二、 测定K-ras野生型及K-ras活性型大肠癌的各自下位信号传导蛋白激酶Raf-1,MEK,MAPK等的活性水平。并比较这些蛋白激酶与此两型(尤其是K-ras野生型)大肠癌发生的相互关系。三、 人大

17、肠癌的K-ras Codon12、13、61出现的点突变与MAPK等蛋白激酶活性间的关系。四、 K-ras Codon13有点突变的大肠癌与JNK信号传导系蛋白激酶活性间的关系。五、 比较上述诸蛋白激酶的活性、突变与人大肠癌不同临床病理特征(病期、类型、转移及预后)的相关关系。拟解决的关键问题： 1. 测定K-ras野生型大肠癌的MAPK及JNK等信号传导蛋白激酶的活性方法。2. 评价伴有K-ras Codon13突变的大肠癌的发生与JNK传导路径相关性及检测手段。3. 大肠癌不同临床病理特征所表现在K-ras点突变及MAPK，JNK信号传导蛋白激酶活性上的分子生物学特点。42.拟采取的研究方

18、法、技术路线、实验方案及可行性分析(之一) 技术路线及实验方案：将手术中获得的大肠癌组织及癌周正常粘膜迅速冷冻保存在-80。从癌组织及其周围正常粘膜中提取DNA，通过PCR-直接序列法测定K-ras Codon12、13、61的点突变，将其分为K-ras活性型(有K-ras基因突变者)与K-ras野生型(无K-ras基因突变者)。称等量癌及其周围正常组织行蛋白提取。使用特异抗体通过Western blot法测定蛋白提取液中的MAPK及JNK的表达及磷酸化水平。如果，在K-ras野生型大肠癌(K-rasWT)中发现MAPK蛋白激酶活性，要用各自特异抗体追加检测其上位蛋白激酶(MEK、Raf)的活

19、性是否存在，如有异常，还将检测各蛋白激酶的基因有否点突变。同时，还要进行JNK蛋白激酶活性测定，如发现异常，用上述方法分别检测及分析JNK的上位蛋白激酶(Rac、Cdc42、PAK、MEKK、SEK1)的活性，如有异常再根据PCR-直接序列法检测其基因有否点突变。通过此方法找出信号传导蛋白激酶的活性异常或基因突变与大肠癌发生的关系。同时，还将比较信号传导蛋白异常与大肠癌的临床病理特征间的关系。研究方法：1)组织标本：共50例分别来自日本神户大学第一外科和北京首都医科大学附属北京同仁医院外科于1997-2000年手术切除的大肠癌组织及其邻近的正常粘膜组织。这些标本用冰生理盐水冲洗后急速冷冻在液氮

20、或-80冰箱中直到实验应用。2)细胞株三种人大肠癌细胞株HT29，SW480和DLD-1均来自日本癌研究材料库。HT29细胞为K-ras野生型大肠癌细胞。SW480细胞，DLD-1细胞为K-ras活性型。3)细胞及组织内蛋白提取取等数量的细胞(株)和称取等量癌组织及其周围正常组织，各自经过前处理成为匀浆后，用SDS标本缓冲液制成悬液。高速离心，收集上清(蛋白)，贮存在-20，待蛋白测定。4)DNA提纯和PCR扩增用DNA Kit从大肠癌细胞及癌标本组织中提取DNA，对其定量。然后将此DNA作为模板在Codon12，Codon13及Codon61处进行扩增。产生约100bp PCR产物。5)测序

21、将PCR产物用DEAE纸从琼脂胶上提纯并用测序PCR进行定量。用20-50g纯化的PCR产物作为模板，在加有dRhodamine Terminator Cycae测序药盒内容的仪器上用3引物进行测序PCR反应，用ABI PRISMTM310基因分析仪对测序PCR产物进行分析。并对变异点上的弱信号，通过亚克隆PCR产物到一个质粒载体上，然后再选出单克隆进行测序，进一步证实突变点上的弱信号是否真正存在变异，以除外假阳性。5-12.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析(之二)6)MAPK及c-Jun(是JNK的靶蛋白，它可反映JNK的活性)等蛋白激酶活性测定使用测定MAPK、MEK、Ra

22、f-1及c-Jun等蛋白激酶的表达(免疫活性)及磷酸化(生物活性)的特异抗体药盒，对从细胞株、癌组织、正常粘膜中提取的蛋白提取液进行Western blot法测定。先加入蛋白表达抗体测蛋白表达量，再将该抗体从膜上洗脱下后加入蛋白磷酸化抗体测其活性，蛋白活性的测定要求每例癌组织要与相应病例的癌周围正常粘膜在同一张膜上同时成对等量对照测定。比较K-ras野生型与活性型大肠癌的MAPK、MEK、Raf-1及c-Jun等蛋白表达及磷酸化情况，找出MAPK、JNK等蛋白激酶与大肠癌发生的关系。7)比较K-ras活性型及K-ras野生型大肠癌的病期、类型、浸润、转移及预后(生存率)等临床病理特征与各信号传

23、导蛋白活性异常的相关关系。8)在信号传导蛋白水平上比较中国人与日本人大肠癌发生的异同。可行性分析：课题组的主要成员多为博士(2人)和硕士(1人)。其中2人已在国外实验室工作和学习6年以上，已熟练地掌握实验所需的分子生物学技术；硕士及技术员也掌握了相应的实验技术。如：细胞培养、DNA提取、PCR扩增、点突变的测序分析及用特异抗体(Western blot法)测定各蛋白的表达及磷酸化等技术。故本课题组完全有能力完成本课题。本校和本院实验室具备与本实验有关的仪器及设备。实验所需材料、试剂的大部分可由日方赠送。课题负责人已完成前期实验，并取得了一些很有趣和有指导意义的实验结果，本实验有成功的把握。3.

24、本项目的创新之处 研究是否MAPK及JNK信号传导系参与大肠癌发生。探讨K-ras野生型大肠癌的发生机制，将会为完善大肠癌的发生学说提供依据。在前期实验中，发现了在K-ras Codon13有突变的大肠癌组织及大肠癌细胞株的MAPK活性低于正常组织这一有趣的现象。它提示此类型大肠癌的癌变可能是通过不同于Ras/MAPK途径的其他(JNK等信号传导路)方式发生的。它可能对大肠癌的发生机制有重要意义。将K-ras点变异及MAPK·JNK活性化与大肠癌的临床病理特征进行比较，讨论大肠癌的不同临床病理特征与信号传导蛋白间的关系，为临床诊疗及判断预后提供依据。5-24. 年度研究计划及预测进展

25、第一年度：细胞实验(三种人大肠癌细胞株即：SW480，DLD-1及HT29)1.DNA和蛋白的提取2.K-ras点突变测定3.MAPK,MEK,Raf-1,c-Jun等蛋白表达及磷酸化的测定(必要时做点突变测定) 第二年度：组织实验(50例人大肠癌的发生及组织及正常粘膜)1.DNA和蛋白的提取2.K-ras点突变测定3. MAPK，MEK，Raf-1及c-Jun等蛋白表达及磷酸化的测定(必要时做点突变测定)第三年度：1.比较和探讨K-ras点变异、MAPK及JNK等蛋白的活性化与大肠癌的发生及其临床病理特征的关系。2.比较和探讨中国和日本不同地域间大肠癌的发生和预后与K-ras点变异、MAPK

26、及JNK等蛋白活性化的关系。3.数据处理、分析，工作总结，撰写论文5.预期研究成果1.证明大肠癌的K-ras分子生物学分型(野生型及活性型)对大肠癌发生学等方面的研究有重要意义。2.证明人大肠癌组织及细胞株内存在MAPK或JNK等信号传导系蛋白的表达及磷酸化的异常和点突变，揭示它们参与人大肠癌的发生。3.发现K-ras野生型大肠癌的发生与MAPK或JNK信号传导系蛋白的异常有关，为半数以上的大肠癌的发生找到分子生物学依据。4.发现K-ras Codon13有点突变的大肠癌组织及细胞株内MAPK活性低于正常组织，提示此类型大肠癌的发生可能是通过不同于Ras/MAPK途径的其他方式发生的；即：可能

27、与JNK等蛋白激酶异常有关，本实验将证明这一点；它将为下一步实验打下良好基础。5. K-ras点变异及MAPK·JNK等信号传导蛋白激酶异常可能与大肠癌的不同临床病理特征有关。即，与大肠癌病期、类型、转移及预后等有关。这可能成为判定大肠癌发生、发展及预后的指标，对临床诊疗有指导意义。6.争取为de novo型大肠癌的发病机制阐明方面提供分子生物学依据。7.研究成果以论著发表形式(国际级及国家级论文3-5篇)及科研成果鉴定。6 四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本人原来所属研究室(中国医大肿瘤研究所)多年来主要从事胃肠肿瘤的病因、病理诊断及治疗学方面的研

28、究，承担过国家自然科学基金两项、卫生部基金四项、辽宁省科委等省级课题二十余项，获资助180余万元，获国家，部、省、市级将多项。目前所在医院的中心实验室具备本实验所需各种条件和设备。申请者一直从事消化道肿瘤的研究及临床工作，在国内外杂志上发表有价值的论文十余篇。并且三次留学日本，在著名专家指导下做了大量实验室研究工作。即：熟练掌握了细胞培养、重组DNA、同位素测定蛋白活性、DNA·蛋白的提取、PCR-直接序列(Sequence)法测定、DNA点突变、Western blot法测定蛋白表达及磷酸化等实验方法。前期实验中在大肠癌细胞株及大肠癌组织内发现了MAPK的活性。还发现，K-ras codon13有突变的大肠癌组织及大肠癌细胞内的MAPK活性低于正常组织。它提示此类型大肠癌的癌变可能是通过不同于Ras