造血干细胞的发育调控

1、造血干细胞的发育调控造血干细胞的发育调控 授课教师：刘授课教师：刘 静静生物科学与技术学院分子生物学研究中心生物科学与技术学院分子生物学研究中心研究方向研究方向1 1：造血发育调控：造血发育调控研究方向研究方向2 2：白血病治疗的分子机制研究：白血病治疗的分子机制研究 造血（造血（hematopoiesis） 造血干细胞造血干细胞(hematopoietic stem cell)分化为分化为早期祖细胞早期祖细胞(primitive progenitor cell) ，经大量增，经大量增殖分化成为晚期祖细胞殖分化成为晚期祖细胞(late progenitor cell)，然，然后再分化为具有特异

2、形态的、骨髓中不同系别的后再分化为具有特异形态的、骨髓中不同系别的前体细胞前体细胞(precursor cell)，最后分化成为各类具，最后分化成为各类具有生理功能的血细胞的整个过程称为有生理功能的血细胞的整个过程称为“造血造血” 。 骨髓中各类前体细胞是各系祖细胞分骨髓中各类前体细胞是各系祖细胞分化走向成熟的过渡形态。化走向成熟的过渡形态。 造血不包括成熟血细胞在体内储存、造血不包括成熟血细胞在体内储存、释放、分配和凋亡的过程。释放、分配和凋亡的过程。第一节第一节 造血器官造血器官 人体的造血器官是生成血液的器官。人体的造血器官是生成血液的器官。 起源于起源于中胚叶中胚叶，主要包括，主要包括

3、骨髓、胸腺、骨髓、胸腺、淋巴结、淋巴结、 肝脏肝脏和和脾脾等。等。 造血过程分为造血过程分为胚胎期造血胚胎期造血和和出生后造血。出生后造血。一、胚胎期造血器官一、胚胎期造血器官 人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、人类的血液细胞首先在卵黄囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均参与造血脾、胸腺和骨髓均参与造血 根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期根据发育过程中造血中心的转移，胚胎期造血分为三个时期：造血分为三个时期： 卵黄囊造血期卵黄囊造血期 、肝造血期、肝造血期 、骨髓造血期、骨髓造血期 1. 卵黄囊造血期卵黄囊造血期（中胚叶造血期）（中胚叶造血期） 始于始于人人胚胎胚胎3周周左右，卵左右，卵黄囊壁

4、上的黄囊壁上的中胚层细胞中胚层细胞开开始分化聚集成团，称为始分化聚集成团，称为血血岛岛（blood island）。血岛）。血岛是人类最初的造血中心。是人类最初的造血中心。 血岛外周的细胞分化为血岛外周的细胞分化为血管内皮细胞。血管内皮细胞。 血岛中央的细胞形成血岛中央的细胞形成多能造血干细胞多能造血干细胞，继，继尔分化成尔分化成幼稚红细胞幼稚红细胞，以后大量的多能造，以后大量的多能造血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织血干细胞迁移至肝、脾、骨髓和淋巴组织继续增殖、分化为继续增殖、分化为干细胞干细胞。 胚胎胚胎 2个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩，个月后，卵黄囊逐渐退化、萎缩，被肝、脾取代其造血功

5、能。被肝、脾取代其造血功能。 2肝造血期肝造血期 始于胚胎第始于胚胎第6周，是卵黄囊血岛的造血干周，是卵黄囊血岛的造血干细胞移植到肝脏的结果，以造细胞移植到肝脏的结果，以造红细胞红细胞为主，为主，后期可生成后期可生成粒细胞粒细胞和和巨核细胞巨核细胞。 肝脏是胚胎肝脏是胚胎25个月的造血中心，持续至个月的造血中心，持续至第第7个月时，逐渐被骨髓造血替代。个月时，逐渐被骨髓造血替代。 此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。此外脾、胸腺、淋巴结等也参与造血。 3骨髓造血期骨髓造血期 自胚胎第自胚胎第14周周骨髓开始造血，骨髓开始造血，5个月个月以后成为胚胎以后成为胚胎期的造血中心。期的造血中心。 骨髓中

6、的造血干细胞来源于骨髓中的造血干细胞来源于肝肝、脾脾，可维持终生。，可维持终生。 胚胎期的骨髓主要生成胚胎期的骨髓主要生成红细胞红细胞、粒细胞粒细胞和和巨核细巨核细胞胞，也生成，也生成淋巴细胞淋巴细胞和和单核细胞单核细胞。 胚胎期造血的三个时期不能截然胚胎期造血的三个时期不能截然分开，此消彼长，互为交错。分开，此消彼长，互为交错。二、出生后造血二、出生后造血 出生后造血主要靠出生后造血主要靠骨髓骨髓。 在正常情况下骨髓是唯一能产生红细胞、在正常情况下骨髓是唯一能产生红细胞、粒细胞和血小板的场所，也生成淋巴细胞粒细胞和血小板的场所，也生成淋巴细胞和单核细胞。和单核细胞。 脾脾和和淋巴结淋巴结为终

7、生制造为终生制造淋巴细胞淋巴细胞的器官。的器官。 1骨髓骨髓 骨髓是位于骨髓腔内的海绵样胶状组织，有骨髓是位于骨髓腔内的海绵样胶状组织，有红骨髓红骨髓和和黄骨髓黄骨髓之分。之分。 婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨髓。婴幼儿的骨髓几乎都参与造血，即全为红骨髓。 约从约从5岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细胞，随年龄岁开始，长骨的髓腔内出现脂肪细胞，随年龄增长，长骨远端的红骨髓转化为黄骨髓。增长，长骨远端的红骨髓转化为黄骨髓。 成人的红骨髓和黄骨髓约各占成人的红骨髓和黄骨髓约各占50%，但黄骨髓仍有造，但黄骨髓仍有造血潜能，当机体需要时又血潜能，当机体需要时又转变转变为红骨髓而参与造血为红骨髓而

8、参与造血。 2. 淋巴器官淋巴器官 分为分为中枢淋巴器官中枢淋巴器官和和周围淋巴器官周围淋巴器官。 中枢淋巴器官中枢淋巴器官主要包括主要包括胸腺胸腺和和骨髓骨髓，主导，主导淋巴细胞的产生、增殖、分化和成熟。淋巴细胞的产生、增殖、分化和成熟。 周围淋巴器官周围淋巴器官主要包括主要包括淋巴结、脾、肠粘淋巴结、脾、肠粘膜相关淋巴组织膜相关淋巴组织等，是淋巴细胞聚集和免等，是淋巴细胞聚集和免疫应答发生的场所。疫应答发生的场所。 3. 髓外造血髓外造血 正常情况下，胎儿出生正常情况下，胎儿出生2个月以后，骨髓以个月以后，骨髓以外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细外的组织如肝、脾淋巴结等不再制造红细胞、粒

9、细胞和血小板。胞、粒细胞和血小板。 但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨但在某些病理情况下，如骨髓纤维化、骨髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢髓增生性疾病及某些贫血，这些组织又恢复造血功能（常可导致相应器官肿大），复造血功能（常可导致相应器官肿大），称为髓外造血。称为髓外造血。 一、造血细胞的生长发育一、造血细胞的生长发育 是一个连续不断的复杂过程，造血器官是一个连续不断的复杂过程，造血器官内的各种造血细胞在造血微环境中通过细胞内的各种造血细胞在造血微环境中通过细胞与细胞之间相互作用，在各种细胞因子的诱与细胞之间相互作用，在各种细胞因子的诱导下，按一定的规律发育成为各种成熟的血导下，按一定的

10、规律发育成为各种成熟的血细胞，然后释放入血循环中。细胞，然后释放入血循环中。第二节第二节 造血造血干干/祖祖细胞的生长发育细胞的生长发育、特性以及特性以及造血调控造血调控 （一）基本过程（一）基本过程 造血细胞的生长发育包括造血细胞的生长发育包括增殖、分化、成增殖、分化、成熟熟和和释放释放四个方面。四个方面。 多多种调节因素控制种调节因素控制该过程该过程，维持血细胞数，维持血细胞数量和质量稳定。量和质量稳定。造血细胞的增殖（造血细胞的增殖（proliferation） 是指血细胞通过分裂而使其数量增加的是指血细胞通过分裂而使其数量增加的过程。有丝分裂是造血细胞的主要增殖方式。过程。有丝分裂是造

11、血细胞的主要增殖方式。 造血细胞的分化（造血细胞的分化（differentiation） 细胞发育过程中失去某些潜能细胞发育过程中失去某些潜能而而获得新功能获得新功能的过程，即由多潜能转变为单潜能的过程。的过程，即由多潜能转变为单潜能的过程。 分裂后的细胞在形态和功能上产生新的特征，分裂后的细胞在形态和功能上产生新的特征，分化过程是不可逆的分化过程是不可逆的。 造血细胞的成熟（造血细胞的成熟（maturation） 造血干细胞定向分化，从原始经幼稚到成熟造血干细胞定向分化，从原始经幼稚到成熟细胞细胞的的发育过程发育过程。血细胞越成熟其形态越易血细胞越成熟其形态越易辨认，功能也日趋完善。辨认，功

12、能也日趋完善。成熟的血细胞在骨成熟的血细胞在骨髓内通过髓内通过“髓血屏障髓血屏障”释放入血循环中。释放入血循环中。（二）造血细胞生长发育（二）造血细胞生长发育阶段阶段 根据造血细胞的功能和形态特征，造血细胞根据造血细胞的功能和形态特征，造血细胞生长发育阶段可分为：生长发育阶段可分为： 造血干细胞、造血干细胞、 造血祖细胞、造血祖细胞、 原始及幼稚细胞原始及幼稚细胞造血干造血干细胞阶细胞阶段段造血祖造血祖细胞阶细胞阶段段原始原始及幼及幼稚细稚细胞阶胞阶段段成成熟熟细细胞胞二、造血干祖细胞二、造血干祖细胞 干细胞（干细胞（stem cell）是具有自我复制和多向分是具有自我复制和多向分化能力的细胞

13、。化能力的细胞。 早期胚胎中的原始生殖细胞即胚胎干细胞，具早期胚胎中的原始生殖细胞即胚胎干细胞，具有广泛的发育和分化潜能，称为有广泛的发育和分化潜能，称为全能干细胞全能干细胞（totipotent hematopoietic stem cell，THSC）。）。 胚胎干细胞分化为各类组织干细胞，造血组织胚胎干细胞分化为各类组织干细胞，造血组织中存在造血干细胞、血管干细胞和间质干细胞。中存在造血干细胞、血管干细胞和间质干细胞。（一）造血干细胞（一）造血干细胞 造血干细胞造血干细胞又称又称多能干细胞多能干细胞，由中胚层细胞，由中胚层细胞分化而来，是各种血细胞的始祖，具有高度分化而来，是各种血细胞的

14、始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细血组织中含量极少，其形态酷似小淋巴样细胞而难以辨认。胞而难以辨认。 1.造血干细胞的基本特征造血干细胞的基本特征 （1）自我更新自我更新 即细胞通过有丝分裂产生的两个子代细即细胞通过有丝分裂产生的两个子代细胞与亲代细胞具有相同的特征。造血干细胞胞与亲代细胞具有相同的特征。造血干细胞的自我更新是维持其数量平衡的基础，亦称的自我更新是维持其数量平衡的基础，亦称自我维持自我维持。高度的自我更新能力是造血干细。高度的自我更新能力是造血干细胞胞最最基本的生物学特征之一基本的生物

15、学特征之一。（2） 造血干细胞静止状态造血干细胞静止状态 干细胞干细胞95%以上细胞处于以上细胞处于G0期静止状期静止状态，不进行态，不进行DNA合成和有丝分裂，当机体合成和有丝分裂，当机体发生缺氧、感染、失血和创伤等应激状态发生缺氧、感染、失血和创伤等应激状态时，干细胞从静止进入增殖的数量增加，时，干细胞从静止进入增殖的数量增加，以满足机体对造血的需求。以满足机体对造血的需求。 （3） 造血干细胞全能性（造血干细胞全能性（多向分化）多向分化） 分化是分化是不可逆不可逆的，一旦定向分化为某种祖细的，一旦定向分化为某种祖细胞，就不可能再变成其胞，就不可能再变成其它它的祖细胞。的祖细胞。 造血干细

16、胞在特定的条件下可以分化成造血干细胞在特定的条件下可以分化成红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、组织红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、组织嗜碱细胞、嗜碱细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀淋巴细胞及自然杀伤细胞等的祖细胞。伤细胞等的祖细胞。（4） 造血干细胞不均一性造血干细胞不均一性 造血干细胞有增殖态与静止态之分，造血干细胞有增殖态与静止态之分，并且不断地在静止和增殖态之间转换。造并且不断地在静止和增殖态之间转换。造血干细胞代龄（有丝分裂的次数）不同构血干细胞代龄（有丝分裂的次数）不同构成了干细胞群体的代龄结构，形成干细胞成了干细胞群体的代龄结构，形成干细胞不均一性。不均一性。 2造

17、血干细胞检测造血干细胞检测 单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是单个细胞在生物体内有能力长期重建造血是判断该细胞为造血干细胞的判断该细胞为造血干细胞的“金标准金标准”。 造血干细胞的数量极少，形态上不能区别，造血干细胞的数量极少，形态上不能区别，干细胞抗原性弱，仅有很少表面抗原。干细胞抗原性弱，仅有很少表面抗原。 （1）脾集落测试法）脾集落测试法 1961年年Till等首先采用体内试验小鼠脾集落形成间接证明等首先采用体内试验小鼠脾集落形成间接证明了造血干细胞的存在：了造血干细胞的存在： 将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造血细胞，将受体小鼠以致死剂量射线照射后，破坏全部造血细胞，再再输

18、以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾输以供体骨髓或血液，小鼠能存活，并在受体小鼠脾中形成红系、粒系、巨核系细胞结节，这些都是由单个中形成红系、粒系、巨核系细胞结节，这些都是由单个细胞增殖分化而来，即脾集落形成单位（细胞增殖分化而来，即脾集落形成单位（CFU-S）；）； 将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也能存活。将脾结节细胞静脉注射给受体小鼠，该小鼠也能存活。证实了骨髓或血液中存在血液细胞的祖先细胞。证实了骨髓或血液中存在血液细胞的祖先细胞。（2）单克隆抗体法）单克隆抗体法 利用利用FACS自动细胞分选系统分选出自动细胞分选系统分选出CD34+CD38+及及CD34+CD38亚群细

19、胞亚群细胞，在无血清体系中加入各种细，在无血清体系中加入各种细胞因子（如胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及及Epo）刺激，）刺激，结果表明，结果表明，CD34+ CD38单个细胞可形成原代集落，单个细胞可形成原代集落，并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等并可向红系、粒系、巨噬系、巨核系等 细胞分化。细胞分化。 CD34+CD38细胞的性能接近于造血干细胞，同时也细胞的性能接近于造血干细胞，同时也证明了造血干细胞具有多向分化的能力证明了造血干细胞具有多向分化的能力。 （3） 造血干细胞的表面标记的流式细胞仪检测造血干细胞的表面标记的流式细胞仪检测 CD34+ 细胞具有长期重建造血

20、的能力；细胞具有长期重建造血的能力； CD34+ CD38细胞比细胞比CD34+ 细胞具有更强的长细胞具有更强的长期造血能力；期造血能力； AC 133+细胞也被认为是早期造血细胞的标志。细胞也被认为是早期造血细胞的标志。（二）造血祖细胞（二）造血祖细胞 造血干细胞进一步分化为各种造血干细胞进一步分化为各种造血祖细胞造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell）。）。 造血祖细胞是一类由造血干细胞分化而来，造血祖细胞是一类由造血干细胞分化而来，但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细但失去自我更新能力的过渡性、增殖性的细胞群，过去称为胞群，过去称为定向干细胞定向干细胞。

21、 造血祖细胞根据其分化能力，可分为造血祖细胞根据其分化能力，可分为多向多向祖细胞祖细胞和和单向祖细胞。单向祖细胞。多向祖细胞可进一多向祖细胞可进一步分化步分化 为单向祖细胞。为单向祖细胞。 通过体外造血细胞半固体培养证实了造血通过体外造血细胞半固体培养证实了造血祖细胞的存在。祖细胞的存在。红细胞爆式集落形成单位红细胞爆式集落形成单位 （BFU-E）红细胞的祖细胞体外培养红细胞的祖细胞体外培养红细胞集落形成单位红细胞集落形成单位 (CFU-E)（三）造血干祖细胞的临床应用（三）造血干祖细胞的临床应用 造血干祖细胞移植主要应用于：造血干祖细胞移植主要应用于：1.血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等

22、；血液系统恶性肿瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障碍血液系统非恶性肿瘤性疾病，如再生障碍性贫血、异常血红蛋白病、性贫血、异常血红蛋白病、Fanconi贫血、贫血、难治性贫血等；难治性贫血等；3.实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵实体肿瘤化疗后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等；巢癌、神经母细胞瘤等；4.其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免疫其他，如重症联合免疫缺陷症、自身免疫性疾病、基因治疗等。性疾病、基因治疗等。 三、造血调控三、造血调控 造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以造血细胞的增殖、分化受控于不同的调控系统，以保持各种血细胞数量和质量的相对

23、稳定。其中细胞保持各种血细胞数量和质量的相对稳定。其中细胞因子的调控占重要地位。因子的调控占重要地位。 细胞因子（细胞因子（cytokines）是一组基因编码的低分子量是一组基因编码的低分子量蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不蛋白质细胞外信号分子，有的是糖蛋白，有的则不含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能含糖基，在机体内含量极低，半衰期短，主要功能是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。是在细胞间传递信息，从而影响造血活动。（一）（一）集落刺激因子类集落刺激因子类( colony-stimulating factors, CSFs ) 主要有以下几种：主要有以下几种：1.红细胞

24、生成素（红细胞生成素（erythropoietin，EPO） 刺激红系祖细胞的增殖和分化，以提高红细胞数量。2.粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子(G-CSF) 除促进粒系祖细胞形成集落外，G-CSF可诱导某些白血病细胞株分化成熟，激活中性粒细胞的吞噬功能。3.粒巨噬细胞集落刺激因子粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 除了促进中性粒细胞、单核细胞祖细胞增殖、分化 成熟外，对成熟细胞也产生作用。4.巨噬细胞集落刺激因子（巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 促进单核系祖细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（多系集落刺激因子（multi-CSF） 促进多系集落生

25、长。6.血小板生成素（血小板生成素（thrombopoietin, TPO） 促进巨核细胞集落形成。（二）白细胞介素（二）白细胞介素（interleukin, IL) 白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，白细胞介素主要是白细胞产生的信号分子，不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与不仅在免疫系统中传递信息，同时也参与造血系统的造血调控。造血系统的造血调控。（三）其（三）其它它细胞因子细胞因子1.干细胞因子（干细胞因子（stem cell factor, SCF） 又称肥又称肥大细胞生长因子大细胞生长因子 促进肥大细胞生长；协同促进造血干祖细胞增殖、分化。2FLT-3配基配基(FLT-3 liga

26、nd, FL) 诱导处于静止期的造血干祖细胞进人细胞周期，促进其扩增。1原癌基因原癌基因 如：如：c-myc基因、基因、ras相关基因、相关基因、c-abl基因、基因、bcl-2 基因、基因、c-kit基因等。基因等。（四）造血基因调控（四）造血基因调控 原癌基因的编码产物可为：细胞因子、细胞原癌基因的编码产物可为：细胞因子、细胞因子受体、细胞内蛋白激酶、细胞内信号传递因子受体、细胞内蛋白激酶、细胞内信号传递分子及转录因子等。分子及转录因子等。 2. 抑癌基因抑癌基因 如：如：p53基因、基因、WT1基因、基因、NF1基因、基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因编码产物通常为基因等。抑癌基因编码产

27、物通常为细胞增殖负调节因子，抑制细胞增殖、诱导终细胞增殖负调节因子，抑制细胞增殖、诱导终末分化、维持基因稳定、诱导细胞凋亡等。末分化、维持基因稳定、诱导细胞凋亡等。 3. 转录因子参与信号转导的调控转录因子参与信号转导的调控 对造血中基本的基因调控机制对造血中基本的基因调控机制 仍存在若干悬念有待研究：仍存在若干悬念有待研究：（1）如何在细胞周期）如何在细胞周期G1与与G0之间来回转换，之间来回转换，并保持绝大多数细胞处于并保持绝大多数细胞处于G0静止状态静止状态? （2）干细胞不对称有丝分裂在基因水平上是）干细胞不对称有丝分裂在基因水平上是怎样实现的怎样实现的?（3）干）干/祖细胞基因怎样调

28、控各类受体表达，祖细胞基因怎样调控各类受体表达，以接受造血微环境中各种正负信号的影响以接受造血微环境中各种正负信号的影响?（4）干细胞在基因水平如何调控向淋巴系或）干细胞在基因水平如何调控向淋巴系或髓系分化髓系分化?祖细胞基因如何决定分化方向祖细胞基因如何决定分化方向?怎样怎样保持各系之间正常恒定比例保持各系之间正常恒定比例? 第三节第三节 造血干祖细胞体外培养技术造血干祖细胞体外培养技术 体内造血干祖细胞在一个极复杂的造血体内造血干祖细胞在一个极复杂的造血微环境中增殖、分化生成血液细胞。微环境中增殖、分化生成血液细胞。 体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内体外造血祖细胞培养就是在体外模拟体内

29、的生理环境，将从机体中分离出的造血祖的生理环境，将从机体中分离出的造血祖细胞进行培养，使之生存、增殖分化。细胞进行培养，使之生存、增殖分化。 造血祖细胞培养的主要应用：造血祖细胞培养的主要应用：1）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量）检测造血祖细胞在骨髓、外周血和脐血中的数量2）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义）研究体外造血祖细胞类型、特性及生理意义3）利用人工培养条件易于严格控制的特点，研究造）利用人工培养条件易于严格控制的特点，研究造 血调节；血调节；4）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、）用于造血系统疾病发生机制，诊断、预后判断、 疗效观察及治疗药物的选择等方面的研

30、究。疗效观察及治疗药物的选择等方面的研究。一、造血干祖细胞体外培养的基本条件一、造血干祖细胞体外培养的基本条件（一）细胞培养室条件（一）细胞培养室条件（二）培养的支持物（二）培养的支持物（三）营养液（三）营养液（四）细胞因子（四）细胞因子（五）血清（五）血清 二、造血干祖细胞体外培养二、造血干祖细胞体外培养（一）造血祖细胞集落培养：（一）造血祖细胞集落培养：（1）分离培养细胞，制成单个核细胞悬液。）分离培养细胞，制成单个核细胞悬液。（2）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、细）配制培养体系：按比例将培养液、细胞、血清、细胞因子加入到培养体系，混匀。胞因子加入到培养体系，混匀。（3）将配制的培养体系在）将配制的培养体系在37水浴中保温水浴中保温10min。（4）将琼脂等支持物煮沸融化（甲基纤维素不需加热）。）将琼脂等支持