仪器分析—质谱 11

1、1Mass Spectrometry2主要参考书主要参考书： Fred W. McLaffert, Frantisek Turecek.Interpretation Of Mass Spectra, 4Ed, (PDF) E.D Hoffmam,J.Charette,V.Stroobant, Mass Spectrometry, Prenciples and Applications, (PDF) ,1996. 分析化学手册（第二版）第九分册 质谱分析.pdf陈耀祖，涂亚平.有机质谱原理及应用 (PDF) 科学出版社 2001Pietro Traldi, Franco Magno, Irma

2、Lavagnini, Roberta Seraglia Quantitative Applications of Mass Spectrometry 2006B.N.帕拉马尼克 (作者), A.K.甘古利 (作者), M.L.格罗斯 (作者), 蒋宏建 (译者), 俞克佳 (译者)电喷雾质谱应用技术 （PDF）20053质谱仪的发展史质谱仪的发展史1898年W. Wien 发现带正电荷的离子束在磁场中发生偏转。 1911年,J.J. Thomson : 世界第一台质谱装置 1918年A. J. Dempster 采用电子轰击技术使分子离子化。1919年F. W. Aston 制得了第一台速度聚

3、焦质谱仪。提出每种同位素的质子和中子在结合成原子核时, 具有特定的质量亏损(并非整数值)。1942年 商品MS出现。 40年代: 用于同位素测定和无机元素分析 50年代： 开始有机物分析（分析石油） 60年代： 研究GC-MS联用技术 70年代： 计算机引入 80年代： 新的质谱技术出现：快原子轰击电离子源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源；LC-MS联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱仪等 目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。4Mass Spectrometry FundamentalsWh

4、at are mass measurements good for ? To identify, verify, and quantitate metabolites, proteins, oligonucleotides, drug candidates, peptides, synthetic organic chemicals, polymers! Biomolecule characterization Proteins, peptides, oligonucleotides, sugars, polymers! Pharmaceutical and medical Bioavaila

5、bility, drug metabolism, pharmacokinetics characterization of potential drugs, drug degradation analysis, screening of drug candidates, identifying drug targets, disease marker identification, diagnostic ! Environmental analysis Pesticides on foods, soil and groundwater contamination Forensic analys

6、is/clinical !5Mass SpectrometryTHE MAIN USE OF MS IN ORG CHEM IS: DETERMINE THE MOLECULAR MASS OFORGANIC COMPOUNDS DETERMINE THE MOLECULAR FORMULA OF ORGANIC COMPOUNDS6质谱分析的基本原理：质谱分析的基本原理：使所研究的混合物或单体形成离使所研究的混合物或单体形成离子，子， ，然后使形成的离子按质荷比，然后使形成的离子按质荷比(mass-(mass-charge ratio)charge ratio)mmz z 进行分离。进行分离

7、。 MM也就是说：质谱分析法是按照离子的质核比（m/z）大小对离子进行分离和测定从而对样品进行定性和定量分析的一种方法。7质谱法的主要作用是：（1）准确测定物质的分子量（2）根据碎片特征进行化合物的结构分析分析时，首先将分子离子化，然后利用离子在电场或磁场中运动的性质，把离子按质核比大小排列成谱质谱。8HOW DO WE ACHIEVE THIS? PERSUADE THE MOLECULE TO ENTER THE VAPOR PHASE (CAN BE DIFFICULT) PRODUCE IONS FROM THE MOLECULES THAT ENTER THE GAS PHASE S

8、EPARATE THE IONS ACCORDING TO THEIR MASS-TO-CHARGE RATIOS (m/z) MEASURE AND RECORD THESE IONS9有机质谱中的各种离子1 分子离子（molecular ion），样品分子失去一个电子而电离所产生的离子，记为 M+。2 准分子离子（quasi-molecular ion），准分子离子常由软电离产生，一般为 M+H +、M-H -3 碎片离子（fragment ion）泛指由分子离子破裂而产生的一切离子。狭义的碎片离子指由简单断裂产生的离子。4 重排离子（rearrangement ion）经重排反应产生的离

9、子，其结构不是原分子结构单元。5 母离子（parent ion）与子离子（daughter ion）任何一离子进一步产生某离子，前者称为母离子，后者称为子离子。6 亚稳离子（metastable ion）是从离子源出口到检测器之间产生的离子。 7 奇电子与偶电子离子（odd- and even-electron ion）具有未配对电子的离子称为奇电子离子，不具有未配对电子的离子称为偶电子离子。 8 多电荷离子（multiply-charged ion）失掉两个以上电子的离子称为多电荷离子。 9 同位素离子（isotopic ion）当元素具有非单一的同位素组成时，产生同位素离子 10Mass

10、Spectrometry Fundamentals What and How-Measure mass (m) to charge (z) ratio (m/z) of ionsa mass of 200 Da with 2 charges gives the same m/z ratio asa mass of 100 Da with 1 charge and cannot be distinguished.-Formation of ions in the gas phase (many ways)positive ion: by adding a proton: (M+H) +or by

11、 removing an electron: (M ) +negative ion: by removing a proton: (M-H) -or by adding an electron: (M) -Charged ions can be manipulated and analyzed by electric and/or magnetic fields (mass analyzers),detected by detectors to generate mass spectra. 11质谱不属波谱范围质谱图与电磁波的波长和分子内某种物理量 的改变无关质谱是分子离子及碎片离子的质量与其

12、相对强度的谱, 谱图与分子结构有关 质谱法进样量少, 灵敏度高, 分析速度快质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法, 而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。 特点12Mass Spectrometry Molecular weight can be obtained from a very small sample. It does not involve the absorption or emission of light. A beam of high-energy electrons breaks the molecule apart. The masses of the

13、 fragments and their relative abundance reveal information about the structure of the molecule. 13 质谱分析原理质谱分析原理 质谱仪器构造质谱仪器构造 质谱定性分析及图谱解析质谱定性分析及图谱解析 质谱定量分析质谱定量分析 蛋白质、肽分析蛋白质、肽分析 要求理解质谱法原理及质谱仪主要部件功能；掌要求理解质谱法原理及质谱仪主要部件功能；掌握质谱定性分析、定量分析及图谱解析方法。握质谱定性分析、定量分析及图谱解析方法。14Mass Spectrometry FundamentalsKey topics

14、: Mass spectrometer Ionization, Mass analyzers, Mass spectrometers Mass spectrum Isotope and mass, Isotope abundance Quality parameters of mass spectrometer Resolution, Mass accuracy, Sensitivity Charge state of protein and peptides MALDI-TOF MS, ESI MS151617 离子源和质量分析器的压力在 104 105 Pa和105 106 Pa。大量氧会

15、烧坏离子源的灯丝；用作加速离子的几千伏高压会引起放电；引起额外的离子分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。 质谱仪构造质谱仪构造1.真空系统真空系统1819所有的质谱都是用来检测离子的，而这些质谱的检测原理不外乎是利用离子在电场、磁场或电磁场中的运动特性来使具有不同质荷比的离子加以区分并检测。离子要在电场、磁场或电磁场中飞行一定的时间和空间，如果在这些时间和空间中存在大量的气体势必会使离子很快淬灭而达不到检测器。所以为了减少离子与背景气体的碰撞淬灭要抽真空使背景气体分子数量大大减少，以维持足够的离子平均自由程。质谱在四大有机谱里，是最灵敏的，而且又很容易与分离手段联用，所以，就可以做到边分离边检

16、测，适用于混合物，而且灵敏度很高。那灵敏度高是怎么实现的呢？就是要有很好的真空！所以，真空是质谱的“心脏”和“灵魂”，没有了真空，质谱肯定歇菜罗！测试仪器中，你要检测一个物质，一定要用方法让它用“电学”或“光学”仪器测到，归根结底是用电路检测到信号，再用放大器等把信号引出检测。所以，从样品开始，你要先让它变成电学可以测到的信号，所以你必须电离你的样品！质谱是高灵敏度的，意味着只有很少的离子进入了下面的分析器。电离完你的样品，你要测量它，就进入了质谱分析器部分，把它变成和m/z有关的部分，在从分析器到达检测器的长长的路程上，如果遇到很多杂质离子，你的样品离子一定会被挡回来，或者被撞散，没有真空，

17、你的离子大部分到不了检测器。要消除这种阻力，就要把杂质离子尽可能排掉。所以，最好的办法就是清路障，抽真空。检测器部分仍旧是要在真空里的，道理同前。最后，获得好的真空就是要用很好的密封装置，然后用泵（机械泵分子蜗轮泵）把装置内的气体抽走。生产工艺是关键，目前国内还真的达不到。真空本身是一门学问。20 在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。 气体可通过储气器进入离子源。 易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子源。 难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入离子源。2.进样系统21Sample Introduction:Direct Insertion Probe (DIP)Vacuum sea

18、lsCeramic tipSample Direct insertion probe Conceptually very easy, practically very tricky22Sample Introduction:Gas Chromatography-MS (GC-MS)Vacuum pump+ He from GCSampleSampleHeTo MS GC output to mass spectrometer Sample already in gas phase23Sample Introduction:Liquid Chromatography-MS (LC-MS) Dir

19、ect infusion of sample in solution Syringe pump: slow steady infusion Output from HPLC Separation and identification of components Vast majority of solution is solvent Must remove solvent to “see” analyte Historically: extra pumping and heating Applicable to electrospray ionisation ESI: see later24分

20、子失去电子，生成带正电荷的分子离子 分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子 M+ eM+.+2eM-. 小于1%M+.A+. +B+CD+. 中性分子或碎片 R.50-70eV3.离子源离子源25质量分析器是质谱仪的核心不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪 不同类型的质谱仪其功能，应用范围，原理， 实验方法均有所不同。 4.质量分析器质量分析器 265.检测记录系统 质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器。经接收放大后被记录。电脑27IONIZING METHODS ELECTRON IMPACT - HIGH ENERGY ELECTRONS AB

21、OUT 70 EV! CHEMICAL IONIZATION LOW ENERGY 281.电子轰击电离 Electron Impact Ionization, EI2.化学离子化 Chemical Ionization, CI3.场电离，场解吸 Field Ionization FD, Field Desorption FD4.快原子轰击 Fast Atom Bombardment, FAB5.电喷雾电离 Electrospray Ionization, ESI6.基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI7.

22、大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI离子化的方法29电子轰击电离又称为电子轰击，或电子电离。是应用最普遍，发展最成熟的电离方法。轰击电压 50-70eV, 有机分子的电离电位一般为7-15eV。可提供丰富的结构信息。有些化合物的分子离子不出现或很弱 1.电子轰击电离 EI30Electron Ionization (EI)3132A Mass Spectrometer3334353637 离子室内的反应气（甲烷等；10100Pa，样品的103105倍），电子（100240eV）轰击，产生离子，再与试样分离碰撞，产生准分子离

23、子。最强峰为准分子离子；最强峰为准分子离子；谱图简单；谱图简单；不适用难挥发试样；不适用难挥发试样；+气体分子气体分子试样分子试样分子+准分子离子准分子离子电子电子(M+1)+;(M+17) +;(M+29) +;2.化学电离（Chemical Ionization，CI）383a.场致电离场致电离Field Ionization Field Desorption （FI，FD）电压：电压：7-10 kV；d1 mm；强电场将分子中拉出一个电子；强电场将分子中拉出一个电子；分子离子峰强；分子离子峰强；碎片离子峰少；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；不适合化合物结构鉴定；阳极+阴极d1mm39

24、 当样品蒸汽接近或接触带高正电位的金属针时，在强电场的作用下发生电离。要求样品分子处于气态，灵敏度不高，应用逐渐减少。3b.场电离 FI40 样品不需汽化, 预先附在处理好的场离子发射体上, 送入离子源, 然后通以微弱电流, 使样品分子从发射体上解吸下来, 并扩散至高场强的场发射区, 进行离子化。 适用于难汽化, 热不稳定的样品. 如: 糖类，肽类，金属有机化合物，聚合物等。3c.场解吸场解吸 FD 41 惰性气体Ar或Xe的原子首先被电离并被加速， 使之具有高的动能，在原子枪(atom gun)内进行电荷交换反应： Ar+（高动能的）+ Ar（热运动的）Ar（高动能的）+ Ar+（热运动的）

25、高动能的Ar或Xe原子束再轰击样品分子使其离子化 4.快原子轰击快原子轰击Fast Atom Bombardment（FAB） 42 FAB是目前广泛使用的软电离技术，适用于难汽化,极性强的大分子。样品用基质调节后黏附在靶物上。 常用的基质有甘油，硫代甘油，3-硝基苄醇，三乙醇胺等。 注意：FAB质谱图中会出现基质分子产生的相应的峰及基质分子与样品分子的结合峰。 例如：3-硝基苄醇作为基质时，会出现 m/z154(MH),136（MHH2O）, 289(MMHH2O) 的峰。 436Electrospray ionization44454647484950515253545556575859基

26、质辅助激光解析离子源基质辅助激光解析离子源760 MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。 MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到分子离子峰，无明显碎片峰。此电离方式特别适合于飞行时间质谱计。 基质辅助激光解析电离Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)61A standard 384 well MALDI sample p

27、late62636465为什么基质重要？基质对于稀释和分散待测物质是非常必要的基质对于稀释和分散待测物质是非常必要的对于离子化的待测物质或其他中性分子，它的功能是能量介质对于离子化的待测物质或其他中性分子，它的功能是能量介质通过质子的离子化，形成一种活性状态。通过质子的离子化，形成一种活性状态。666768离子源技术比较 MALDI 多用于极性/带电荷的肽 可耐盐 适用于复杂基质 必须离线分析 由于基质吸附相对分辨率低 基质 1000 m/z 光偶联和衰减 Nobel Prize in Chemistry, 2002 ESI 多用于非极性的肽. 对盐敏感 对复杂基质耐受性低 需要专业人士操作和

28、维护 可与 LC联用 Nobel Prize in Chemistry, 200269Niggard spectra (polymer additive), obtained by negative APCI (A), negative APCI with in source fragmentation (B), electron impact ionisation (C). 707172737475 Separate ions according to m/z ratio Five basic types of analyser:1) Magnetic sector (electrostat

29、ic)2) Quadrupole3) Ion traps4) Time of flight5) FTICR质量分析器质量分析器 Mass Analysers76质谱仪的主要技术指标质谱仪的主要技术指标 质量范围： 指质谱仪所检测的单电荷离子的质核比范围 分辨率（R）：分辨率是质谱计分开相邻两离子质量的能力。 分辨率（ R ）是两峰间的峰谷为峰高的10%时的测定值，即两峰各以5%的高度重叠。 R = m / m m为质谱计可分辨的相邻两峰的质量差m为可分辨的相邻两峰的平均质量77Mass Analysers:Factors to Consider Upper mass limit: Highes

30、t m/z that can be detected May be offset by multiple charges Resolution: Distinct signals for similar m/z ratios Transmission: Ratio of ions reaching detector: ions produced Cost78Mass Analysers:Resolution (Resolving Power) Ability to resolve two signals of similar m/z Resolved if valley is 85The Ma

31、ss SpectrumMasses are graphed or tabulated according to their relative abundance.=861b.双聚焦分析器双聚焦分析器离子源离子源收集器收集器磁场磁场电场电场S1S2+-方向聚焦：方向聚焦： 相同质荷比，入射方向不同的离子会聚；能量聚焦：能量聚焦： 相同质荷比，速度(能量)不同的离子会聚； 质量相同，能量不同的离子通过电场和磁场时，均产生能量色散；两种作用大小相等，方向相反时互补实现双聚焦；87 其他类型质量分析器其他类型质量分析器双聚焦质谱仪体积大；双聚焦质谱仪体积大；色谱色谱-质谱联用仪器的发展及仪器小型化（台

32、式）需要；质谱联用仪器的发展及仪器小型化（台式）需要；体积小的质量分析器：体积小的质量分析器：四极杆质量分析器四极杆质量分析器飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器离子阱质量分析器体积小，操作简单；分辨率中等；882.四极质量分析器 四极质谱计 四极质谱结构简单，价廉，体积小，易操作，无磁滞现象，扫描速度快，适合于GC-MS, LC-MS。分辩率不高。 +Electron BeamABCSample inIon Beam89Mass Analysers:Quadrupole Mass Analysers Relatively cheap and compact Low (unit

33、) resolution R 2,000 Upper mass limit of m/z 4,000 Can be offset by use of ESI (multiple charges) Simple to operate and control Simple interfacing with inlet systems GC, DIP, etc. Workhorses of mass spectrometry90quadrupole mass analyzer / filter四级杆分析器（四级杆滤质器）9192Mass filtering and “scanning”滤质器（分析器

34、）和扫描与 TOF的分析器不同四级杆分析器是在特定的电压频率下，具有特定m/z的离子才可到达检测器在实时分析时电压是不断变化的，这就是对离子束进行扫描93Tandem mass spectrometers串联质谱 两个质谱顺序联接 离子先通过第一个质谱再通过第二个质谱。 增加分辨率 两个质谱间信号衰减94Triple-sector Quadrupole (Q/Q)三重四级质谱95Types of Scans I Product / daughter ion scans子离子扫描Like PSDSector #1: filter for one specific precursor / pare

35、ntSector #2: scan the fragments / products / daughters96Types of Scans II Dynamic exclusion 动态排除动态排除自动子离子扫描自动子离子扫描首先分析贡献大的母离子首先分析贡献大的母离子, 并收集并收集 MS2 的子离子的子离子然后排除这些母离子然后排除这些母离子, 然后分析低然后分析低丰度的离子丰度的离子97Types of Scans III Precursor / parent scans 母离子扫描Sector #2: set to filter / detect one product/daught

36、er massSector #1: scan to ID the parent responsible98Types of Scans IV Neutral loss 中性丢失 两个质谱顺序扫描 串联扫描按照一个特定的质量数(e.g., 80 amu) 寻找特定的母/子离子对 (e.g., = 80 amu: loss of phosphate from pS/pT)993.离子阱离子阱 Ion trop100电喷雾电喷雾离子阱质谱离子阱质谱101102103104105Ion Trap mass spectrometers I离子阱 离子被捕获在一个离子被捕获在一个稳定的轨道中，并稳定的轨道

37、中，并在磁在磁/静电瓶中富静电瓶中富集集 场的改变可使特定场的改变可使特定的的m/z离子离子 被甩出被甩出到达检测器到达检测器. 灵敏度极高灵敏度极高, 分辨分辨率一般率一般106Ion Trap mass spectrometers II 也可改变场的频率使也可改变场的频率使特定的特定的m/z的离子的离子, 撞到电极上淬灭（撞到电极上淬灭（be quenched ）. 而后使剩下的离子被而后使剩下的离子被甩出，到达检测器甩出，到达检测器107Ion Trap mass spectrometers III 或者在淬灭了部分或者在淬灭了部分离子后，将剩下具离子后，将剩下具有特定有特定m/z 离子

38、加离子加速，产生高能量的速，产生高能量的碰撞和碎裂碰撞和碎裂 然后将这些碎片在然后将这些碎片在甩出，到达检测器甩出，到达检测器分析分析108Ion Trap mass spectrometers IV (MS3). 这次除了感兴趣的子离这次除了感兴趣的子离子淬灭所用的离子子淬灭所用的离子 然后将子离子进一步碎然后将子离子进一步碎裂，再将碎片甩出到分裂，再将碎片甩出到分析器分析析器分析 看进行一次又一次的多看进行一次又一次的多重循环重循环 These sequential fragmentations are like physical sectors1094.飞行时间质谱飞行时间质谱11011111211311411575.离子回旋离子回旋116117Ion cyclotron