植物组织培养与器官培养课件

1、植物离体无性繁殖植物离体无性繁殖 简称离体繁殖简称离体繁殖（in vitroin vitro propagation propagation)、微微型繁殖型繁殖（micropropagationmicropropagation)，是指利用离体是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方并在短期内获得大量遗传性一致的植株的方法（技术）。法（技术）。 用这种方法得到的植株群体称单株无性系。用这种方法得到的植株群体称单株无性系。(来自一个单

2、株（或一个单芽），它们遗传组成相同来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同) 近近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。杨树等已在种苗生产上广泛应用。植物离体无性繁殖的意义（优越性）植物离体无性繁殖的意义（优越性）繁殖速度快，经济效益高繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受地区季节限占用空间小，不受地区季节限制，便于工厂化育苗制，便于工厂化育苗可以繁殖各种珍稀、涉危苗木可以繁殖各种珍稀、涉危苗木 离体繁殖周期：离体繁殖周期：13个月个月 繁殖系数：几繁殖系数：几十几百倍十几百倍 又称快繁又称快繁

3、离体繁殖是建立在离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，体细胞系的基础上，是在人工控制的环是在人工控制的环境条件下，不会造境条件下，不会造成性状分离，也不成性状分离，也不会退化，同时还可会退化，同时还可避免病虫害的侵染。避免病虫害的侵染。利于筛选突变体，为育种服务利于筛选突变体，为育种服务手指玫瑰手指玫瑰 由根由根组织培养组织培养的蒲的蒲公英幼苗公英幼苗植物离体无性繁殖的方式植物离体无性繁殖的方式 器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type) 胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type

4、) 不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type) 器官型器官型(organ type)(organ type) 原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type) 球茎芽型球茎芽型 块茎型块茎型 鳞茎型鳞茎型 孢子型孢子型 根茎型根茎型 微枝扦插型微枝扦插型 器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)： 诱导器官外植体产生诱导器官外植体产生愈伤组织愈伤组织，经分化培，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。养形成芽、根再生成植株的方式。 技术关键

5、：外植体诱导产生的愈伤组织要早技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。期挑选，使其来源尽量一致。 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。芦荟、烟草、油菜等芦荟、烟草、油菜等 无菌母株制备无菌母株制备增殖、分化增殖、分化植株再生及鉴定植株再生及鉴定炼苗和移植炼苗和移植器官发生型器官发生型基本程序基本程序培养基中激素配比培养基中激素配比激素种类及浓度激素种类及浓度基本培养基组成基本培养基组成渗透压渗透压逐步过渡逐步过渡培养基筛选培养基筛选材料灭菌材料灭菌胚状体发生型

6、胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)： 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。分化形成胚状体再成苗的方式。 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。萌发率和提高胚状体同步化率。 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。完整，繁殖系数高；遗传性稳定。甘蔗、胡萝卜、石刁柏等甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)a

7、dventitious bud type)： 选取具有顶芽和腋芽的短枝选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植过程，最后使其生根形成植株的方式。株的方式。 技术关键：打破顶端优势，技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。促使腋芽增殖并促其生根。 特点：繁殖率高、保持物种特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。的繁殖。FLash器官型器官型(organ

8、 type)(organ type) 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 技术关键：对培养基要求高，控制好激素技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。浓度，避免愈伤组织发生。 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等丝石竹等 原球茎型原球茎型(protocorm type)(proto

9、corm type) 兰属特有的方式，兰属特有的方式，即外植体经培养即外植体经培养产生原球茎，再产生原球茎，再直接长成植株。直接长成植株。球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出

10、根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，球茎芽，一端出芽一端出根一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植土中种植 唐唐菖菖蒲蒲观观叶叶海海棠棠块茎型块茎型 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根化出芽和根 块茎芽可为繁殖系母体，

11、不断切割繁殖块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高移栽，成活率高 。 花叶芋花叶芋 鳞茎型鳞茎型 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合百合 郁金香郁金香孢子型孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长间较长 地钱地钱狼尾蕨狼尾蕨根茎型根茎型 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢根状茎

12、上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快子型快 肾蕨等肾蕨等 微枝扦插型微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树葡萄、杨树 3.1.3 培养基3.1.3.1 无机盐无机盐无机盐培养基的组成培养基的组成3.1.3.1 无机盐3.1.3.2有机物有机物 氨基酸类氨基酸类 重要的有机氮源重要的有机氮源 维生素类维生素类 以辅酶形式参与植物细胞代以辅酶形式参与植物细胞代谢活动，对生长、分化具有很好的促进谢活动，对生长、分化具有很好的促进作用作用 vb1， vb6 糖类糖类 主要的碳源主要的碳源蔗

13、糖？蔗糖？ 天然有机添加物类天然有机添加物类 CM（椰乳）、马（椰乳）、马铃薯汁、酵母提取液（铃薯汁、酵母提取液（YE）、番茄汁等）、番茄汁等蔗糖浓度分别为蔗糖浓度分别为0 0、1%1%、5%5%3.1.3.3 调节物质（一）生长素类（一）生长素类 促进细胞伸长生长和分裂、促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽细胞分裂素配合可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。的萌发与生长、胚状体的产生等。常用的有常用的有2,4-D2,4-D、NAANAA、IBAIBA、IAAIAAIAAIAA

14、为天然植物生长素，见光易分解，高温高压为天然植物生长素，见光易分解，高温高压易受破坏；易受破坏；2,4-D2,4-D有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动有抑制芽形成的作用，一般用于细胞启动脱分化阶段；脱分化阶段；诱导分化则用诱导分化则用NAANAA、NBANBA或或IAAIAA。IBAIBA诱导生根效诱导生根效果最好。果最好。（二）细胞分裂素类（二）细胞分裂素类 促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化促进细胞分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老。抑制离体组织或器官衰老。 常用的有常用的有6-BA、 KT 、 Z

15、T6-BA6-BABA分别为分别为0, 0.1, 5mg/LNAA分别为分别为0, 0.1, 5mg/L（三）赤霉素类（三）赤霉素类 主要应用主要应用GA3，促进体细胞胚发育成小植，促进体细胞胚发育成小植株，株，GA3不耐热，水溶解后不稳定，应采不耐热，水溶解后不稳定，应采用过滤除菌，并用酒精溶解。用过滤除菌，并用酒精溶解。 脱落酸脱落酸 抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激抑制蛋白质合成，抵消和抑制上述三种激素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。素发挥作用；诱导休眠、促进衰老和脱落。 乙烯乙烯3.1.3.4 植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制 培养基母液的配制培养基母液的配制 大量

16、元素一般配成大量元素一般配成10倍浓度的母液；倍浓度的母液； 微量元素和有机营养常配成微量元素和有机营养常配成100倍浓度的母液；倍浓度的母液； 混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以混合定容时，注意药剂的添加顺序及稀释度，以免沉淀；免沉淀； 生长调节类物质不溶于水生长调节类物质不溶于水,需用不同溶剂进行溶解需用不同溶剂进行溶解 单独配制的试剂：单独配制的试剂： 铁盐与铁盐与EDTA CaCl2 前前P28以以KNO3为例为例1L培养基需要量为培养基需要量为19g。在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。在母液中的浓度为在母液中的浓度为190g/L，即，即0.19

17、g/ml在配制培养基时，取在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g回回P263.1.3.4 植物细胞工程培养基配制植物细胞工程培养基配制 培养基配制过程培养基配制过程 药品药品 按顺序混合按顺序混合 pHpH调整调整 加热溶解加热溶解 器皿器皿 水洗水洗 干燥干燥 分装培养基分装培养基 加塞加塞 冷却冷却 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 3.1.3.5 常用培养基 到目前研制开发了数十种适宜不同植物、到目前研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方。但多数培养基配方是在几种普遍配方。但多数培养基配方是在几种普遍应用的培养

18、基上演变而来的。应用的培养基上演变而来的。 这几种常见的培养基为是：这几种常见的培养基为是：MS、ER、B5、N6、NT、White等，其配方如下：等，其配方如下：培养基分类培养基分类 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以根据培养基无机盐含量的差异将其分为以下下4类：类：高无机盐含量培养基（植物器官、花药、高无机盐含量培养基（植物器官、花药、细胞及原生质体培养）；细胞及原生质体培养）；-MS较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科和单子叶植物的组织和花药培养）；和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5中等无机盐含量培养基（花药培养）；中等无机盐含量培养基（花药培养

19、）；-H低无机盐含量培养基（生根）。低无机盐含量培养基（生根）。-WHITE3.1.4 植物组织培养问题分植物组织培养问题分析析3.1.4.13.1.4.1试管苗玻璃化现象（试管苗玻璃化现象（vitrificationvitrification） 是指组织培养过程中的特有的一种生理失是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。态异常的现象。 玻璃化苗绝大多数为玻璃化苗绝大多数为 来自茎尖或茎段来自茎尖或茎段 培养物的不定芽。培养物的不定芽。 通常玻璃化苗通常玻璃化苗 恢复正常的比例很低，恢复正常的比例很低， 在继代培

20、养中仍然在继代培养中仍然 形成玻璃化苗。形成玻璃化苗。玻璃化的解决方法玻璃化的解决方法增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；水势；减少培养基中减少培养基中NH4+浓度；浓度；增加光照；增加光照；增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；试管苗玻璃化的现象发生；降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。入适量

21、脱落酸。3.1.4.2 褐变问题褐变问题 成因 酶促-酚氧化成醌及聚合 非酶促-醌聚合 时段 初代培养初代培养 继代培养继代培养 选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 使用抗氧化剂使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能

22、够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。 材料预处理和细胞筛选材料预处理和细胞筛选 使用吸附剂使用吸附剂 0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭的活性炭、PVP对防止褐变也有较为对防止褐变也有较为明显的效果。明显的效果。 连续转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔1224h1224h的培养后，再转的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d7-l0d后，褐变现象便后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。会得到控制或大为减轻。减轻褐变现象发生的方法减轻褐变现象发生的方法3

23、.1.4.3 微生物污染问题微生物污染问题 原因原因 消毒不彻底消毒不彻底 外植体消毒问题外植体消毒问题 培养基及器皿消毒问题培养基及器皿消毒问题 环境消毒问题环境消毒问题 无菌操作不过关无菌操作不过关外植体消毒问题外植体消毒问题 外植体取材外植体取材 外植体外植体(expant)是指用于离体培养的活的是指用于离体培养的活的植物组织。植物组织。来源：来源：外植体消毒问题外植体消毒问题外植体灭菌的过程：外植体灭菌的过程：流水冲洗流水冲洗1020min表面消毒表面消毒无菌水冲洗无菌水冲洗45次次 沥水待用沥水待用 Flash常用消毒剂消毒灭菌效果比较常用消毒剂消毒灭菌效果比较消毒剂消毒剂使用浓度使

24、用浓度%去除的难易去除的难易 消毒时间消毒时间min 效果效果次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钠次氯酸钠漂白粉漂白粉溴水溴水过氧化氢过氧化氢升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸银硝酸银9102饱和溶液饱和溶液1210120.11707545(mg/L)1易易易易易易易易最易最易较难较难易易中中较难较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好较好较好好好容器容积容器容积（mL）121下所需的最下所需的最少灭菌时间少灭菌时间( (min）205075250500100015002000152025303540培养基灭菌培养基灭菌 手术刀手术刀 镊

25、子镊子 平皿平皿 干热灭菌干热灭菌 150-160，2h 环境消毒问题环境消毒问题无菌操作问题无菌操作问题评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否评价下列操作正确与否无菌操作无菌操作 无菌操作前的准备工作无菌操作前的准备工作 无菌操作台的使用无菌操作台的使用 操作所用器械应浸泡在操作所用器械应浸泡在95%酒精中，用前需放在酒精中，用前需放在耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用耐热器皿中加入少量酒精后进行灼烧，每次使用后都要灭菌。后都要灭菌。 无菌操作步骤无菌操作步骤 外植体的适当切割的注意

26、事项外植体的适当切割的注意事项 继代培养的材料继代培养的材料( (液体材料、固体材料）液体材料、固体材料）3.1.4.4 其他问题 培养条件控制培养条件控制 激素水平激素水平 光照：时间，强度和光质。光照：时间，强度和光质。 温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在温度：适温有利于细胞分裂与分化，而在一定范围内降低培养温度可以使细胞的质一定范围内降低培养温度可以使细胞的质量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官量增加；培养基昼夜变温可能有利于器官的发生。的发生。 pH pH 通常使用的通常使用的pHpH值的范围是值的范围是5.55.56.56.5。pH4pH77，培养物不能正常生长。，培养物不能正常生

27、长。 气体气体激素水平的控制激素水平的控制 生长素应用的浓度范围为生长素应用的浓度范围为0.115mg/L。 在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以成愈伤组织，以2,4-D最为有效。最为有效。 细胞脱分化需要高浓度的细胞脱分化需要高浓度的2,4-D，当胚性，当胚性细胞形成转入再分化时，则需较低的细胞形成转入再分化时，则需较低的2,4-D浓度。浓度。 使用浓度范围为使用浓度范围为0.110mg/L。 细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细细胞分裂素既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。胞分化。16h/d24h/d0h/d液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频

28、率的关系液体振荡培养的愈伤组织生长与振荡频率的关系3.2 植物胚胎培养Flash 概念概念花药培养属于花药培养属于器官培养范畴器官培养范畴花粉培养属于花粉培养属于细胞培养范畴细胞培养范畴也称小孢子培养也称小孢子培养花药及花粉培养花药及花粉培养把发育到一定阶段的花药接种在人把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植工培养基上，使其发育和分化成植株的过程株的过程从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程培养使其脱分化并发育成植株的过程 获得单倍体植株获得单倍体植株 花药培养的基本程序：花药培

29、养的基本程序： Flash 选处于生殖生长高峰期的花药，需低选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（温预处理（310，210天），天），光照先弱后强。光照先弱后强。花药培养花药培养目的及程序目的及程序花粉或小孢子的分离花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养目的及方法花粉或小孢子培养目的及方法目的：获得单倍体植株目的：获得单倍体植株 花药看护培养花药看护培养 花粉悬浮培养花粉悬浮培养 固液双层培养固液双层培养花粉培养方法花粉培养方法3.3 毛状根培养毛状根培养 定义：毛状根定义：毛状根(hairy roots)是（双子叶）植株是（双子叶）植株或组织、器官经发根农杆或组织、器官经发根农杆菌（菌（Ag

30、robacterium rhizogenes）感染后，）感染后，形成的类似头发一样的根形成的类似头发一样的根组织。又称发状根。组织。又称发状根。 1934年，年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根染苹果树产生发根 。 毛状根的特性毛状根的特性 特性：特性： 毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。多分枝，多根毛，无向地性。 生理生化和遗传稳定。生理生化和遗传稳定。 为什么可以不依赖激素？为什么可以不依赖激素？ 发根农杆菌的发根农杆菌的Ri质粒上的质粒上的T-DNA片断整合进片断整合进植物细胞核基因组中。植物细胞核基因组中。 T-DNA上有生长素合成基因上有生长素合成基因tms 1 和和tms 2能够指导能够指导IAA的合成。的合成。 3.3.1 毛状根的