单克隆抗体制备技术

1、 单克隆抗体制备技术 2008年11月6日杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理1：HAT选择培养基： 次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 氨基蝶呤(aminopterin,A) 胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).2：细胞的DNA合成一般有两条途径：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与反应。B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理HAT培养基的选择原理：A：氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细

2、胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨基蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。B：瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。C：B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活57d，且功能下降)。D：融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。免疫程序与检测方法的建立o免疫程序o建立检测方法o检测免疫效果免疫程序免疫程序 取6-8周龄BalbC雌鼠，首免，每只鼠用0.5 mL含50 g的重组蛋白与10 % 体积的ISA15A VG 佐剂混匀，颈背部皮下多点注射；间隔3 w进行二免，免疫原、剂量和方法同上；再间隔2

3、 w进行三免，免疫原不含佐剂，腹腔注射，剂量同上。细胞融合前3 d加强免疫，腹腔注射0.5 mL含50-100 g纯化的蛋白。 3-5天后用于融合。 免疫程序免疫程序 免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100g，第二次为50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l06-1107。检测方法的建立及免疫效果的评价A：建立成熟的检测方法是关键，一般有以下几种方法： ELISA IPMA 免疫荧光B：免疫效果的评价 一般于三免疫后一周，通过尾静脉采血检测抗体产生情

4、况，一般以稀释1000倍仍为阳性判为免疫成功。杂交瘤细胞株的建立o SP2/0细胞的准备 o 饲养层细胞的制备o 免疫脾细胞的制备o 融合 o 阳性杂交瘤的筛选 o 细胞的冻存与复苏o 单克隆抗体的制备 SP2/0细胞的准备o SP2/0细胞在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。o 融合前24-48 h将SP2/0细胞分瓶扩大培养，融合前6 h，弃去瓶中培养液，换上新液。o 融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于15 mL离心管内，1000 rpm离心5 min，用5 mL无血清的1640悬浮沉淀，再离心一次

5、，然后用无血清的1640培养液重新悬浮，细胞计数，取107细胞悬液备用。 饲养层细胞的制备o融合前一天制备饲养细胞，一般选用8周龄Balb/C小鼠腹腔巨噬细胞，步骤如下：1.将Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做阴性对照），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。2.用无菌剪刀剪开皮肤，用无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜。3.用5mL无菌注射器吸取5mL HAT选择培养液注入到小鼠腹腔中（严禁刺破肠管），注射器不拔出，然后用无菌镊子轻轻触动几次左右两侧腹膜，吸出营养液。4.重复1次上步操作，补足20mL HAT选择培养液，混匀后加入2块96孔板，100L/孔，放入37 CO2培养箱培养。（此为经验

6、操作，标准操作要进行细胞计数，浓度为1105/mL；如果做2块饲养细胞，吹两次即可，如果做3块则加吹一次）免疫脾细胞的制备o加强免疫3-5天后小鼠眼球采血（作为阳性对照，尽量多的采血，否则脾中红细胞较多，影响融合），然后拉颈处死，浸泡在75%酒精内，5min。o用无菌剪刀剪开皮肤，无菌镊子撕开皮肤，暴露腹膜；再用无菌剪刀剪开腹膜，暴露脾脏；无菌取脾脏，无血清1640洗一次，去除结缔组织；无菌注射器吸取1640培养液，将脾细胞吹出；1000rpm离心5min，细胞用1640培养液洗1次，细胞计数，取5107-1108脾细胞悬液备用。 融 合o将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10-1：5的比例混合在一起

7、，在15mL离心管中用无血清1640洗1次，离心，1000rpm,5min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。o60s内加入37预温的1mL 50%PEG溶液，边加边轻微摇动。37水浴静置作用90s。o加37预温的1640培养液以终止PEG作用，首先，1 min加入1 mL，然后在5 min内缓慢加入10mL，终止后置于37作用5min。o离心，800rpm, 5min。o弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动，用40mL含HAT选择培养液轻轻重悬。o将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100L。一般一个免疫脾脏可接种4-6块

8、96孔板。o将培养板置37、5%CO2培养箱中培养。 培养天数培养天数 脾细胞脾细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 饲养细胞饲养细胞 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 0 良好良好 良好良好 良好良好 可见融合细胞可见融合细胞 1-2 开始死亡开始死亡 锐减锐减 良好良好 成成2-3个亮细胞个亮细胞 3-4 大部死亡大部死亡 几乎完全死亡几乎完全死亡 良好良好 成簇成簇3-5，10个细胞个细胞 5-7 死亡死亡 死亡死亡 变形变形 100个左右细胞呈小岛个左右细胞呈小岛 7-14 死亡死亡 死亡死亡 变形变形 1/3-1/5孔底面积孔底面积融合后各种细胞的情况换液换液：融合之后5d换液，吸出150L，加入200

9、L HT营养液。融合过程中注意事项o SP2/0细胞与免疫脾细胞数比例适当。o 两种细胞要处于较好的状态，吹吸细胞时要轻柔。o PEG融合之后，加营养液中和时要缓慢，以免将破坏融合细胞。阳性杂交瘤的筛选o 杂交瘤细胞长到孔底1/5-1/10时可以进行检测，一般情况下10d即可；还可以当营养液发黄时检测。o 取样：无菌取杂交瘤培养上清，然后在原孔中加入HT培养液。o 应用已经建立起的检测方法筛选阳性孔，以制备PCV2-Cap单抗为例： 用重组PCV2-Cap蛋白和野生型杆状病毒包被ELISA板进行平行检测，每孔加入50L杂交瘤细胞培养上清液（如果同时检测项目繁多，可以统一稀释2-5倍进行检测）。

10、重组PCV2-Cap蛋白检测为阳性而野生型杆状病毒为阴性的的杂交瘤细胞转入24孔板进行扩大培养（HT培养液）， 长至80%单层时再检测一次，如果仍然为阳性则立即进行进行亚克隆。阳性杂交瘤的筛选过程中注意事项o 检测杂交瘤细胞的时机很重要，早了抗体产生量少，不易检出；晚了细胞死亡较多，不利于后续培养及亚克隆。o 从96孔板中取样品之后应立即补上HT培养液，利于细胞保持较好的状态。o 取样时做好标记，以免造成错误。杂交瘤细胞的亚克隆原则o 对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果

11、会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。杂交瘤细胞的亚克隆的方法o 24孔中细胞生长状态良好的杂交瘤细胞可以进行亚克隆，将细胞用营养液吹起，适当稀释后进行细胞计数，取100个细胞加入到20mL含20% FBS营养液中，混匀后加到96孔板中，200L/孔。也可以亚克隆前一天制备饲养层细胞，再进行亚克隆。当细胞长至孔底1/5-1/10时（大约10天）进行检测，将具有单个克隆的阳性细胞孔继续进行第二次亚克隆，当亚克隆之后检测到每个杂交瘤细胞孔都为阳性为止，一般要经过3次亚克隆。亚克隆过程中注意事项o 亚克隆之前可

12、以制备饲养层细胞，促进杂交瘤细胞生长；如果细胞状态好，也可以不用饲养层细胞。o 在细胞计数前应该将杂交瘤细胞做适当的稀释，稀释倍数根据细胞量而定，10-100倍不等。细胞计数时将细胞控制在2-10104/mL，这样计数时即快又准。o 第一次亚克隆时，为了确保成功，可以取200个细胞进行亚克隆。o 如果细胞生长不良，可以中途换液，把细胞吹散。细胞的冻存与复苏o 单抗的制备是一个较长的过程，中途可能会发生污染而前功尽弃，所以要及时进行细胞的冻存：各个时期的阳性孔杂交瘤细胞都要冻存。 将生长状态良好的细胞吹起后，1000rpm离心5min，弃上清，用冻存液将细胞重悬，之后冻存，程序如下：4 放置1h

13、，-20 放置4h，-80 过夜，然后置液氮中保存。o 细胞的复苏：从液氮中取出细胞，迅速置于37 水浴锅中迅速融化细胞，营养液稀释后1000rpm离心5min，弃上清，用营养液将细胞重悬之后常规培养。单克隆抗体的制备o 培养上清法 将阳性杂交瘤扩大培养，直到细胞全部死亡，收集培养液冻存备用，该法单抗含量少。o 腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mL Pristane (降植烷) 或液体石腊于BaLbc鼠，1周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110

14、mL腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。单克隆抗体的鉴定o 抗体特异性的鉴定 o McAb的Ig类与亚类的鉴定 o Western-blot分析 o McAb中和活性的鉴定 o McAb识别抗原表位的鉴定 o McAb亲和力的鉴定 抗体特异性的鉴定o除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA、IPMA等法。McAb的Ig类与亚类的鉴定o 采用商品化的亚类鉴定试剂盒进行。Western-blo

15、t分析o 以抗PCV2 的单抗为例：取纯化的PCV2病毒进行SDS-PAGE分析，然后将其转印到硝酸纤维素膜（NC）上，与筛选到的5株单抗进行Western-blot，以SP2/0培养上清作为对照，HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)为二抗，用3，3-二氨基联苯胺（DAB）底物溶液显色、拍照。McAb中和活性的鉴定o 以抗PCV2单抗为例，用固定病毒稀释抗体的方法进行病毒中和试验用于检测单抗的中和活性。将杂交瘤细胞培养上清液和腹水按 1: 2系列稀释，分别与含有 200 个TCID50 的 PCV2/LG 株等体积混合，置37 感作3 h；同设 PCV2 阳性血清、SP2/

16、0 细胞培养上清作为阳性和阴性对照。病毒接种细胞培养至72 h，固定细胞，用 PCV2 阳性血清进行IPMA检测各孔病毒抗原反应，将能够抑制50 %病毒增殖的抗体最高稀释倍数定为抗体中和效价。 McAb识别抗原表位的鉴定o 采用间接ELISA法相加试验，计算相加指数（AI）来分析单抗决定簇，具体做法如下： 在包被好抗原的ELISA板中分别加入各种单抗（均为稀释5倍）各100L，以及各单抗两两组合各50 L，37孵育1 h，后序步骤与常规ELISA相同。根据下列公式计算AI，A1，A2分别为各株单抗的A值，A1+2为两两组合的混合单抗的A值。AI 大于10%表示两株单抗针对不同抗原表位，具有相加效应； AI小于10%则表示两株单抗针对抗原表位相同或相近。AI= （A1+2- A1）/ A2100%McAb相对亲和力的鉴定o 采用ELISA法，用抗原包被ELISA板，一抗为不同稀释度的单抗，二抗为羊抗鼠IgG，ABTS显色后测定A值。再以单抗的浓度的浓度为横坐标，以其相应的A值为纵坐标，绘制标准曲线。从标准曲线上根据直线中点对应的各株单抗的浓度，即可求出各株单抗的相对亲和力。溶液的配制o HAT选择培养液： 76 mL 1640营养液 20 mL FBS（PAA） 2 mL HAT（Sigma，50X） 2 mL 5.6%碳酸氢钠溶液 100