藜麦叶片多酚最佳提取工艺及其抗氧化性研究

1、藜麦叶片多酚最佳提取工艺及其抗氧化性研究粮食工程14EIE季静雅材料、试剂和仪器1. 1材料和试剂 选用品种“PI596498”为试验材料进行多酚最佳提取条件研究。同时精选田间性状较好的9个黎麦品种:TEMUCO Quinoa TRADITIONAL, Quinoa B.Rain Sow , Temuco;1591 Quinoa Cherry , Tomico Quino-a, CQ一TEMVCC(夭玛)，PI814932 , PI596293 , Tumu-co ( 7 ) hybrids。供试材料均由海西海航生态农业科技有限公司和浙江农林大学提供。 没食子酸标准品和Folin一Ciocal

2、teu、显色剂:上海源叶生物科技有限公司;DPPH (1,1一biphenyl一2-picrylhydrazyl radical ):东京化成工业株式会社。1.2仪器设备 SHZ一D IQ予华牌循环水真空泵:巩义市予华仪器有限责任公司;752PC紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;SY一150 W超声波:上海宁商超声仪有限公司。试验方法1材料预处理 黎麦盆栽种植40 d后，即植株处于生长发育阶段的开花期，分别摘取10个不同品种的新鲜叶片，于阴凉通风处晾干后，置80鼓风干燥箱烘干，待冷却后粉碎过0. 5 mm孔筛，密封干燥备用。2标准曲线的制备 参考陆国权等标准曲线的制备，得到的标准曲线方

3、程是:Y=0.075 1X一0. 008 3 ,R= 0.99893多酚的提取和测定 取0. 5 g黎麦叶粉末置于250 mL圆底烧瓶中，加人一定体积分数的乙醇在一定条件下回流浸提，并将浸提液进行减压过滤后收集。 取不同条件下的提取物1 mL定容至10 mL，然后从中取0. 2 mL提取物按照上述标准曲线的测定方法测定样品液的吸光度，并根据线性回归方程计算多酚提取得率，3次重复取平均值。4单因素试验 试验对乙醇浓度、提取时间、料液比进行单因素分析，分别考察这3个因素对黎麦叶片多酚提取的影响。5试验设计 根据单因素试验结果，以乙醇浓度、浸提时间、料液比3个因素为自变量，多酚得率为响应值进行三因素

4、三水平响应面试验。通过Design Expert8.0.6软件对试验数据进行回归分析，得到黎麦叶多酚提取的最优工艺参数。6清除DPPH的测定 准确称取DPPH标准品10 mg，溶于无水乙醇中，超声5 min，充分震荡，并定容于100 mL容量瓶中，配成0. 1 mg/mL DPPH储备液，置于冰箱中备用。取不同质量浓度的黎麦叶多酚提取液2 mL，分别加人0. 1 mg/mL DPPH溶液2 mL，摇匀，在黑暗中放置30 min，以无水乙醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度A样品，用无水乙醇代替DPPH溶液按上述方法测定吸光度A对照，用无水乙醇代替黎麦叶多酚提取液按上述方法测定吸光度为A空白

5、。按公式计算DPPH清除率。 DPPH清除率= (1一(A样品一A对照)/A空白)x 100% 7清除OH测定 在试管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeS04溶液，2 mL不同质量浓度的多酚提取液，2 mL 6 mmol/LH2 02溶液，摇匀，静置10 min，再加人2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，摇匀，静置30 min，以蒸馏水为空白于波长510 nm处测定其吸光度A样品，用蒸馏水代替水杨酸按上述方法测定吸光度A对照，用蒸馏水代替多酚提取液按上述方法测定吸光度A空白。按公式计算OH清除率。 OH清除率=(1一(A样品一A对照)/A空白)x 100%8黎麦叶片多酚含量的品种间差

6、异 采用所筛选的最佳提取条件和方法测定所选9个黎麦品种，以明确黎麦叶片多酚含量的品种间差异。结果与分析1多酚得率的单因素试验1.1乙醇浓度对多酚得率的影响 以料液比为1:40，在80条件下提取1h，考察不同乙醇浓度对多酚得率的影响(见图1)。结果表明，多酚得率随乙醇浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，乙醇体积分数在85%时达到最大值，故确定乙醇最佳体积分数为85 %。1.2浸提时间对多酚得率的影响 以70%乙醇、料液比1:40为提取溶剂量，在80下浸提，考察不同提取时间对多酚得率的影响(见图2)。结果表明，多酚得率随着时间的推迟而呈现出“M”的趋势。在1h提取多酚得率最高，为缩短工时和能耗，提取

7、时间以1h为宜。 1. 3料液比对多酚得率的影响 以乙醇浓度为70%在80条件下浸提1h，考察不同料液比对多酚得率的影响(见图3)。结果表明，多酚得率随着料液比的增加先呈现上升后持续下降直到趋向于较稳定，由图3可知，料液比为1: 30时多酚得率到达最大值，故以此为最佳提取比例。 2蔡麦叶片多酚得率响应面分析2.1工艺参数优化 以乙醇浓度为83 % ( X )、浸提时间1 h(X )和料液比为1:30(X )为中心点，用响应面分析方法进行三因素三水平优化，中心组合试验的因子及编码值见表1，中心试验设计及试验结果见表2。 以多酚得率Y为响应值，利用Design Expert 8. 0软件进行回归拟

8、合，得到多酚得率预测值对编码自变量的回归方程: Y=0.30一(2. 625E一003 ) X +( 6. 250E一003 ) X -0. 073X 一(3.500E一003 ) X X 一(5. 750E一003 ) X X -(1. 500E一003 ) X X 一0. 033X 一0. 016X +( 3.125E-003 )X 表3中回归模型的方差分析显著性检验表明，该回归模型P=0. 000 3 0.05，不显著，表明该模型方程极显著，不同处理间的差异高度显著，说明这种试验方法是准确可靠的，使用该方程模拟真实的三因素三水平的分析时可行的。该回归模型的总决定系数矿= 0. 964 6

9、，调整决定系数矿= 0. 919 1，说明该模型的拟合程度较好，试验误差小。因此该回归方程模型成立，可以用此模型对黎麦叶片多酚的提取进行分析与预测。 从表3可以看出，影响多酚得率的主次因素为料液比浸提时间乙醇浓度，同时可以看出，因素一次项二次项(X 、X )对多酚得率的影响是高度显著(P0.1)，说明可能相互交互的影响不是很大，但还有待进一步验证。回归模型预测的黎麦多酚提取的最佳工艺条件为:乙醇体积分数为83%，以1: 20料液比在80下浸提1. 12 h，在此条件下，多酚得率在理论上可达0. 381 5扩100 g。采用这一提取工艺条件可最大限度的提取多酚，且提取结果与Pasko等,Gawl

10、ik一Dz-iki等研究结果基本保持一致。 2. 2响应曲面试验结果分析 为了更直观地表现出对多酚得率的影响，绘制以特定的响应面Y对应的因素X,、凡、凡构成的1个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析图上可以找到它们在反应过程中的相互作用。回归优化响应面曲面图及等高线图(见图4)。由图4可知，响应面开口向下，随着每个因素的增加，响应值增大，当响应值增大到极值后，随着因素的增加，响应值逐渐减小。该模型有稳定点，且稳定点是最大值。等高线图中曲线是随着响应面的增加而形成一个顶点，也就是最佳提取量。 3蔡麦叶多酚抗氧化活性试验 PawePasko等研究

11、认为黎麦种子及新芽中的总多酚有较高的抗氧化性。Go mez一Caravaca等通过高效液相色谱仪确定了黎麦中的17种游离酚和5种结合酚类化合物。Alvarez一Jubeto等WHirose等研究认为黎麦总多酚中含有懈皮素、山奈酚、原儿茶酚、香草酸及其衍生物、咖啡酸衍生物等，其中以榔皮素和山奈酚含量最多3.1黎麦叶多酚对DPPH的清除能力 黎麦多酚对DPPH清除作用见图5。由图5可知，黎麦叶多酚对DPPH表现出很强的清除作用，清除能力与浓度呈正相关。在2一14g/mL内，随着黎麦叶多酚浓度的增加，对DPPH清除能力开始显著增加，达到一定质量浓度(4 g/mL)后，趋向于稳定，其ICS。值为1 .

12、876 g/mL。 3. 2黎麦叶多酚对OH清除能力 由图6可知，随着多酚质量浓度的增加，对OH清除效果增强，通过对数据进行统计分析的多酚质量浓度与清除率的回归方程为y = 1. 7335x +36. 543 , R = 0. 998 6。运用SPSS 19. 0软件分析，得黎麦叶多酚清除OH自由基的半抑制率(IC50)为6.520 g/mL。 2. 4蔡麦叶多酚含量的品种间差异分析 由表4可知，黎麦叶多酚含量在不同品种间存在较大差异，变异幅度从0. 448一0. 675扩100 g,均含量为0.572 g/100 g，变异系数为14. 47% 。其中，以品种“Temuco”多酚含量最高，其次

13、依次是TomicoQuinoa ,Tumuco(7)hybrids、“CQ一TEM-VCC(夭玛) , 1591 Quinoa Cherry , PI814932 ,“QuinoaB. Rain Sow”、“TEMUCO Quinoa TRADI-TIONAL ,PI596293 ,PI596498，其中“1591 Qui-noa Cherry”和“PI814932”多酚含量相等。黎麦表面的紫色粉层可能影响着其多酚的提取得率。 3结论 响应面试验设计分析结果表明，提取黎麦叶片多酚的最佳组合为:乙醇体积分数83%，提取时间1.12 h，料液比1：20。本研究通过对所提取多酚的抗氧化性分析的结果表明