报告往届硕士

1、分类号： ：10426： 2010052005 学校代码学号： 密级MASTER DEGREE THESIS纳米通道电化学单分析检测酶：程 涛作者：魏庆莉李雪梅指导教师：分析化学学科专业：070302专业代码：生化分析研究方向2013 年04 月 10 日纳米通道电化学单分析检测酶完成日期：2013 年 04 月 10 日指导教师签字：答辩委员会成员签字：纳米通道电化学单分析检测酶摘要单检测技术在分析领域的应用十分的广泛，本文主要是应用单检测技术研究酶的活性。本文的研究是基于溶血素纳米孔道的单电化学检测来讨论限制性核酸内切酶和凝血酶的活性。以溶血素通道为基础，将膜片钳放大技术与电化学检测技术相

2、结合，实现限制性核酸内切酶和凝血酶单的检测及传感分析。利用核酸内切酶对特点的限制性内切以及凝血酶与凝血酶适体亲和作用的原理，设计了不同的特定的 DNA 链，通过观察分析限制性核酸内切酶或凝血酶作用于 dsDNA 后，DNA 通过纳米孔道时的微电流变化，从而达到研究限制性核酸内切酶和凝血酶活性的目的。本共分为五章：第一章，概述了纳米通道、核酸内切酶以及纳米粒子的简介及作用并简单介绍了单检测技术、凝胶电泳技术以及膜片钳放大检测技术等分析方法。着重对单检测技术和纳米通道进行了说明，对单检测技术的前景做了介绍。第二章，采用单电化学检测初步研究了 DNA工作，主要研究了限制性内切酶的活性。通过用溶血素和

3、卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链 DNA 和双链 DNA 通过孔径时不同的电流下降，来初步对 DNA工作进行了解。在限制性内切酶的作用下双链 DNA 能顺利的通过纳米孔道，通过对比限制性内切酶作用前后电流的变化进而对限制性内切酶的活性进行研究。第三章，通过凝胶电泳技术和纳米金标记 DNA 在 TEM 下的图像来研究限制性核酸内切酶的活性，以及错配碱基 T 与 T 在 Hg2+条件下能形成 T-Hg-T 的稳定存在。首先通过限制性内切酶作用前后的 DNA 在凝胶电泳下进行分离，观察分离的情况来研究限制性内切酶的，其次当 DNA 被纳米金修饰后，观察在限制性内切酶作

4、用前后，DNA 上修饰的纳米金在 TEM 表征下的不同来研究限制性内切酶的活性。同时在以上的实验中剪切位点有错配碱基 T 与 T 的时候，限制性内切酶不能作用，只有当在 Hg2+条件下，形成 T-Hg-T 的稳定结构后，限制性内切酶才能发生作用。第四章，通过溶血素纳米孔道研究凝血酶单的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链 DNA 和双链 DNA 通过孔径时不同的电流下降。研究了凝血酶与是凝血酶适体的亲和作用，当凝血酶作用下的 ssDNA 才能顺利的通过溶血素纳米孔道，同时也研究了颈环结构的解链时间与电压的关系。利用核酸适体实现单个酶的检测，对单个

5、酶的实时生物化学反应和酶催化动力学进行研究，研究单个酶在许多非特异性结合位点中如何找到特异性位点，为解决生命科学中的理论依据。第五章，结论部分，对全文内容进行了总结。问题提供：核酸内切酶；凝血酶；单检测；溶血素；纳米通道ELECTROCHEEMICAL DETECTIONG OF SINGLEENZYME MOLECULES BASED ON NANOCHANNELABSTRACTThe technology of single molecule detection is widely applied in the field of analysis, this paper mainly re

6、searchs the activity of enzyme by the technology of single molecule detection. The research of this paper is based on the single molecular electrochemical detection of hemolysin nanopores to discuss the activity of restriction endonuclease and thrombin. Using the principle of endonucleases restricti

7、on of a specific site and the affinity function of thrombin and thrombin aptamer, the different specific DNA chains are designed. when restriction endonuclease or thrombin acts on the dsDNA, the microelectric current when DNA throughing nanopores will bedifferent, so as to achieve the purpose of res

8、earching the activity of restriction endonuclease and thrombin. This thesis is divided into five chapters:The first chapter, this paper summarizes the introduction and function of nanochannel, endonuclease and nanoparticles of and simply introduces the analytical method of single molecule detection,

9、 microgel electrophoresiss and the patch clamp amplifier detection. This paper especially illustrates the single molecule detection and nanochannel, at the same time the prospects of the single molecule detection is presented.The second chapter, the single molecule detection is used to preliminary s

10、tudy theDNA sequencing and mainly study the activity of restriction enzymes.Usingthecharacteristics of hemolysin aperture to control the different current when the single-strand DNA and double-stranded DNA through the pore, this paper preliminary understands the DNA sequence by using the biological

11、nanopores of hemolysin and lecithin free assembed. Under the action of restriction enzymes, the double-stranded DNA can smoothly through the nanopore. By comparing the current change before and after restriction enzymes function, the restriction enzymes activity is studied.The third chapter, by micr

12、ogel electrophoresiss technology and the the TEM images of DNA tagged by AuNPs, the restrictive endonucleases activity is studied, aswell as the mismatch base T and T can stably exist under the condition of Hg2+. Firstlystuding the activity of the restriction enzyme by observing the separation, whic

13、h is the DNA under the microgel electrophoresiss before and afte the restriction enzymes action. Secondly after the DNA is tagged by AuNPs, studing the activity of the restriction enzyme by observing nanoparticless different characters in TEM. At the same time in the above experiments, which have mi

14、smatch base T and T the restriction enzymes can not act on the DNA. Only when under the condition of Hg2+, formed the stable structure of T-Hg-T, the restriction enzymes can work.The fourth chapter, through the hemolysin nanopores, the activity of thrombin molecule is studied. Using the characterist

15、ics of hemolysin aperture to control the different current when the single-strand DNA and double-stranded DNA through the pore, this paper preliminary understands the DNA sequence by using the biological nanopores of hemolysin and lecithin free assembed. This paper researchs the affinity of thrombin

16、 and thrombin aptamer. When under the action of thrombin, the ssDNA can smoothly through the hemolysin nanopores. At the same time, the time of melting the chains of neckring structure is relevant to the voltage.The fifth chapter, it was summarized for the whole thesis.KEY WORDS: Endonuclease; Throm

17、bin; Single molecule detection; Hemolysin;Nanochannel目录第一章 绪论 11 纳米通道1.1 自然态的通道1.1.1 生物膜离子通道 11112333341.1.2 溶血素跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道 1.2 人工的通道2 核酸内切酶2.12.22.32.4核酸内切酶简介核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶作用限制性内切酶的性质及应用3 单检测（single molecules detection, SMD） 55556777888991111113.1 DNA 简介 3.1.1 DNA 的成分3.1.2 DNA 的空间结构3.1.3 DNA

18、的稳定性3.2 适体 3.2.13.2.2适体简介 适体的特点 3.3 单检测的分类3.3.13.3.23.3.33.3.4光谱分析法 电化学检测法 生物动力学工具法 单检测的应用前景 4 纳米粒子4.1 纳米粒子简介4.1.1 纳米粒子的性质 4.2 纳米金粒子 4.3 二氧化铈纳米粒子 12135 凝胶电泳分析5.1 电泳简介 5.1.1 电泳技术与应用5.1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳6 膜片钳放大检测技术1515151517171717186.16.26.3膜片钳技术简介 电压钳位 单通道电流7 立题依据和研究内容第二章 基于溶血素纳米孔道检测 Nb.BbvCI 内切酶单191 前言192

19、 实验部分2.1 试剂与仪器 2.1.1 主要试剂2.1.2 仪器装置2.2 实验方法 2.2.1 DNA 储备液及缓冲溶液 2020202021 21212121212223242426262.2.22.2.32.2.42.2.52.2.62.2.7样品的卵磷脂的处理仪器操作磷脂双层膜在磷脂双层膜上形成纳米孔道 检测 P1、P2、P3 通过纳米孔道时的电流信号 3 结果与讨论3.1 实验原理 3.2 实验过程 3.2.1 检测 P1 穿过纳米孔道时的电流变化 3.2.2 检测 P2 穿过纳米孔道时的电流变化3.2.3 检测 P3 穿过纳米孔道时的电流变化3.3 讨论 P1、P2、P3 穿过纳

20、米孔道时的电流脉冲282930334 小结第三章 基于纳米金胶标记 DNA 的电化学检测 341 前言342 实验部分2.1 试剂与仪器 2.1.1 主要试剂 2.1.2 仪器装置 2.2 实验方法 35353535363636363637383838383838383941414243442.2.1 纳米金胶的2.2.3 凝胶电泳样品的2.2.4 透射电子显微镜分析（TEM）的样品的2.2.4.1 巯基 DNA 的前处理与修饰 2.2.4.2TEM 的样品 3 结果与讨论3.1 实验原理 3.2 利用凝胶电泳分离 DNA 3.2.1 制胶 3.2.1.13.2.1.23.2.1.330%凝胶

21、制得 50 TAE 缓冲液 固定凝胶 3.2.2 凝胶电泳分离 DNA 3.3 利用 TEM 表征反应前后的溶液3.3.1 纳米金溶液 TEM 表征 3.3.2 G1、G2 的 TEM 表征 3.3.3 G3、G4 的 TEM 表征 3.3.4 G5、G6 的 TEM 表征 4 小结47第四章 基于溶血素纳米孔道检测凝血酶单481 前言482 实验部分2.1 试剂与仪器 2.1.1 主要试剂2.1.2 仪器装置2.2 实验方法 2.2.1 DNA 储备液及缓冲溶液 4949494950 50505050505151525455592.2.22.2.32.2.42.2.52.2.6样品的卵磷脂的

22、处理仪器操作磷脂双层膜在磷脂双层膜上形成纳米孔道 2.32.42.52.6实验原理 检测颈环结构 S1 穿过溶血素孔道的电流信号检测凝血酶加入前后杂环 DNA 穿过溶血素孔道的电流信号 讨论 G1、G2、G3 穿过纳米孔道时的电流脉冲3 小结第五章 结论 60参考文献61致谢65附录：攻读学位期间已和待的学术目录 6667独创性第一章 绪论1 纳米通道纳米孔一般定义为内径为 1 100 nm 的微孔，若孔的深度远大于孔径，就称之为纳米孔道，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。纳米通道根据其形成方式可以分为自然态的通道以及人工的通道。1.1 自然态的通道1.1.1 生物膜离子通道离子通道依

23、据其活化的方式不同，可分两类：一类是电压活化的通道，即通道的开放受膜电位的控制，如 Na+、Ca+、Cl-和一些类型的 K+通道；另一类是化学物活化的通道，即靠化学物与膜上受体相互作用而活化的通道，如 Ach 受体通道、氨基酸受体通道、Ca+活化的 K+通道等。细胞不停地进行新陈代谢活动，就必须不断地与周围环境进行物质交换，而细胞膜上的离子通道就是这种物质交换的重要途径.人们已经知道，大多数对生命具有重要意义的物质都是水溶性的，如各种离子，糖类等，它们需要进入细胞，而生命活动中产生的水溶性废物也要离开细胞，它们出入的通道就是细胞膜上的离子通道。生物膜离子通道是各种无机离子跨膜运输的通路。生物膜

24、对无机离子的跨膜运输主要有运输和主动运输两种方式。运输的通路称离子通道，主动运输的离子载体称为离子泵。生物膜对离子的通透性与多种生命活动过程密切相关。例如，感受器电位的发生，神经兴奋与传导和中枢神经系统的调控功能，心脏搏动，平滑肌蠕动，骨骼肌收缩，激素磷酸化过程中跨膜质子梯度的形成等。，光合作用和氧化1.1.2 溶血素跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道溶血素可以与磷脂双子层自组装形成自然态的生物纳米孔道。溶血素的内部孔道是刚性的，它可以使得小型的离子和带电的通过，对于大物质是不能通过的，因此以溶血素纳米孔为基础的生物膜在电化学检测池中可以降电化学检测池分割成由微孔相连的两个部分。在一定的电压下带电

25、的离子或带电微型分子可以定向地从通道内通过。不同的电压下，孔道内的电流是不一样的，当 DNA或者 RNA穿过时会产生下降电流，同时会有下降的脉冲，脉冲的宽度与链的长短成正比的，而且通过纳米孔道时，脉冲的数量、时间等与组成 DNA 或 RNA的碱基数量有关。生物大在外界下穿过由等绝缘材料制作的纳米孔或生物纳米孔时会导致通过小孔离子流的阻塞，小孔电导率的瞬时变化反应了这个过程，电流的减低量反映粒子的体积大小，而电流变化的次数则反映生物大分子的数目。1.2 人工的通道尽管溶血素孔能够满足生物大的研究，但是由于其自身性质的原因注定其本身的不稳定性，使得形成的纳米孔道同样比较短而且自身的孔径的控制比较局

26、限，这就促使人们对新一类的纳米孔道的探索1。固态纳米孔道具有孔径稳定，物理性能良好等优势。常用的固态纳米孔道是应用 Si3N4 晶体膜。制造固态纳米孔道的技术里最常见的是聚焦粒子束技术，它专门应用于光刻掩模版修补和集成电路修饰。人工的纳米通道还有碳纳米管、聚合膜通道、Al2O3 膜通道，其中碳纳米管通道在目前应用比较广泛，碳纳米管的研究主要是基于石墨烯的研究，目前对于石墨烯的研究越来越多，在各个领域都有相关的，因此人工制造的碳纳米管纳米通道成了现在单检测的热点。2 核酸内切酶2.1 核酸内切酶简介内切酶，即限制性核酸内切酶，亦称限制性核酸酶。它是一种能催化多核苷酸的链断裂的酶，只对脱氧核糖核酸

27、内一定碱基序列中特置发生作用，把这位置的链切开。通过内切酶可以把某一个遗传片段剪切下来，若再连接在别的生物细胞的遗传上，便可使这生物细胞具有新的遗传特性。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以 NEB 为代表的许多公司开始寻找的限制性内切酶。除了某些以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。现在人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已的原核组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。限制性酶的功能是在 DNA的内部拆卸水解，甲基化酶作用是修饰，DNA经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，从而避免了限制性酶

28、对自身 DNA 的破坏。2.2 核酸内切酶的分类核酸内切酶主要分为三类: 内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的； 内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的 DN段，并能构建来自不同组的 DN段，形成杂合 DNA； 内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DN链末端。段，具有各种单2.3 限

29、制性核酸内切酶作用限制性核酸内切酶（以下简称限制性酶）是一类识别双链 DNA 中特定核苷酸序列的 DNA 水解酶，以内切方式水解 DNA，产生 5-P 和 3-OH 末端。 1952 年 Luria 等及 1953 年 Bertani 等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。Arber 及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其 DNA 的降解，但宿主自己的 DNA 并不降解，据此他们提出了限制性修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及 DNA 甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对 DNA 底物有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在 DNA内部拆卸水解，甲基化酶

30、是修饰，DNA经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，而甲基化酶只修饰宿主自身的 DNA，从而避免了限制性酶对自身 DNA 的破坏。2.4 限制性内切酶的性质及应用限制性内切酶是一种生物蛋白。限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中， 酶切时甘油的浓度不应超过 1/10 体积。否则对酶活性有抑制作用。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳的切割能力和位点的专一性，所以要用专一的反应缓冲溶液。随着科学技术的发展限制性内切酶广泛应用于很多领域如 DNA物的 DNA 分析、DNA 切割技术、DNA 的重组等。、微生限制性核酸内切酶在生物学研究中占有极其重要的地位，

31、几乎每一个研究领域都离不开限制性内切酶，其应用非常广泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，将庞大的DNA切割成小片段便于序列分析；DNA重组和组建新质粒；建立DNA的物理图谱等。3 单检测（single molecules detection, SMD）单检测是一种在水平上检测灵敏度达到极限的技术，是对低含量物的技术2。单质检测起着检测技术为分析化学的检测提供了很多的可能性，极其有效的推动着分析化学的进展，目前单检测技术在分析化学领域已经取得了不少的成果。单检测不仅可以对不均匀的体系中的单个进行识别，同时也能对其进行分类、定量分析，同时它对生物大的结构和功能也能提供很多的重要信息。单检测技术以其独特的优势将在分析化学、生物、3-5。、纳米分析等领域开辟新的路径和科研3.1 DNA 简介1954 年 4 月 DNA 双螺旋提出后，整个生物学界呈现出少有的五彩缤纷的景象，被认为是 20 世纪以来生物科学中最伟大的成果，是生物学史上一个新，。生化方面在 21 世纪吸引无、个性化疯子诊断、生物云计为生物科学，农业科学，医学的发展开辟了数眼球的热门词汇比如人类组计划、算，这些都和 DNA有很大的关系。（遗传因子）是遗传物质的基础，是 DNA 或 RNA上具有遗传信息的特定核苷酸序列。人类大约有几万个，储存着生命孕育、生长、凋谢过程的全部信息。现代人们