实验10双缩脲法测定蛋白质含量ppt课件

1、实验十实验十 双缩脲法测定双缩脲法测定蛋白质浓度蛋白质浓度一、实验目的1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法二、原理一、分光光度法的根本原理及方法一、分光光度法的根本原理及方法一利用吸收光谱对物质进展定性分析一利用吸收光谱对物质进展定性分析维生素维生素B12溶液的吸收光谱溶液的吸收光谱主要方法：主要方法：1比较吸收光谱曲线比较吸收光谱曲线2比较最大吸收波长比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为蛋白质的最大吸收波长为280nm；核酸的最大吸收波长为核酸的最大吸收波长为260nm。3比较吸光度的比值比较吸光度的比值 纯纯DNA：8 . 1280260nmnm

2、AA二利用吸收光谱对物质进展定量分析二利用吸收光谱对物质进展定量分析1原理原理Beer-Lambert比尔定律：比尔定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=cl 其中：其中：T为透光率；为透光率；A为吸光率；为吸光率；I0为入射光强为入射光强度；度；I为透射光强度；为透射光强度；为摩尔消光系数；为摩尔消光系数；C为溶液浓度；为溶液浓度；L为溶液光为溶液光程的厚度程的厚度 2常用方法1规范曲线法规范曲线与样品的测定条件必需一致。2规范管法规范管法 CX/AX=CS/AS，知，知CS，测定，测定AS、AX可求得可求得CX。3摩尔吸光系数法摩尔吸光系数法C=A/为为L=1cm，C为为1 m

3、ol/L时的吸光系时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。数，也称为摩尔吸光系数。 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反响生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中参氨，氨与硫酸反响生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中参与强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽与强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用规范酸溶蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用规范酸溶液进展滴定，滴定所用无机酸的量液进展滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测相当于被测样品中氨的量样品中氨的量m

4、ol，根据所测得的氨量即可计，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。算样品的含氮量。 由于蛋白质含氮量通常在由于蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样，便得到该样品的蛋白质含量。品的蛋白质含量。 Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry法法)测定蛋白质浓度测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反响，在碱性溶液中，能与因此有双缩脲反响，在碱性溶液中，能与Cu2+构成构成络合物。络合物。Folin酚反响是在双缩脲反响的根底上，引酚反响是在双缩脲反响的根底上

5、，引进进Folin试剂试剂(磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂)，蛋白质，蛋白质铜络铜络合物能复原磷钼酸合物能复原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏倍，较双缩脲法灵敏100倍。其缺乏之倍。其缺乏之处是此反响受多种要素干扰。处是此反响受多种要素干扰。Tris缓冲剂、蔗糖、缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸。硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸。 紫外分光光度法测定

6、蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收顶峰在吸收顶峰在280 nm波优点。在此波长范围内，蛋白波优点。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可与其含量呈正比关系，可用作定量测定。用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不耗费样品、可回收利用、低浓度盐类不干简便、不耗费样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。

7、扰测定。 含有核酸的样品：含有核酸的样品：蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A2800.74A260 总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCABicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉二辛可宁酸、二羧基二喹啉 准确灵敏：准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是试剂测定范围是0.5-20g/ml 快速：快速：45分钟内完成测定，比经典的分钟内完成测定，比经典的Lowry法快法快4倍而且更加方便倍而且更加方便 经济适用：除试管外，测定可在微孔板中进展，大经济适用：除试管外，测定可在微孔板中进展，大大节

8、约样品和试剂用量大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝根本原理：根本原理： 碱性条件下，蛋白将碱性条件下，蛋白将Cu2+复原为复原为Cu+，Cu+与与BCA试剂构成紫颜色的络合物，测定其在试剂构成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的处的吸收值，并与规范曲线对比，即可计算待测蛋白的浓吸收值，并与规范曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。度。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋考马斯亮蓝在一定蛋白质

9、浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以，因此可以经过测定染料在经过测定染料在595nm595nm处光吸收的添加量得处光吸收的添加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高比干扰物质少、灵敏度高比LowryLowry法灵敏法灵敏4 4倍。倍。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH

10、2CH3SO3Na+双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质* * 双缩脲反响：双缩脲在碱性条件下双缩脲反响：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围法测定蛋白质范围1-10mg1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3NH3 双缩脲双缩脲 三、操作步骤三、操作步骤1.取取15支试管，按下表编号、加试剂支试管，按下表编号、加试剂2.各管混匀后，参

11、与双缩脲试剂各管混匀后，参与双缩脲试剂3.0mL,37oC反响反响30min。3.以以0号管调零，测定各管号管调零，测定各管540nm光吸收值。光吸收值。四、结果处置四、结果处置1.绘制规范曲线绘制规范曲线 以牛血洁白蛋白含量为横坐标，以牛血洁白蛋白含量为横坐标，OD540为纵为纵坐标，绘制规范曲线。坐标，绘制规范曲线。2.样品的计算样品的计算 根据样品的根据样品的OD540从规范曲线上查得样品的从规范曲线上查得样品的蛋白质含量蛋白质含量mg/mL，再根据样品的体积，再根据样品的体积算出样品的浓度。算出样品的浓度。五、本卷须知五、本卷须知1. 须于显色后须于显色后30min内测定，且各管由显色

12、到比内测定，且各管由显色到比色时间应尽能够一致。色时间应尽能够一致。2.*样品蛋白质含量应在规范曲线范围内。样品蛋白质含量应在规范曲线范围内。3. 比色杯的运用比色杯的运用微量表达法10-3 (g, m, L) milligram 毫克 mg10-6 microgram 微克 g10-9 nanogram 纳克 ng10-12 picogram 皮 克 pg10-15 femtogram 飞克 fg10-18 attogram 阿、渺克 ag 10-24 zepto仄普托 沙克 zgppm: parts per million 1 g/ml 1ppmppb: parts per billion

13、 1 ng/ml 1ppbppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt五、分光光度计的运用五、分光光度计的运用仪器操作键引见仪器操作键引见“方式设定键方式设定键MODE：用于设置测：用于设置测试方式试方式“100%T/0ABS键：用于自动调整键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比透射比)或或0ABS(零吸光度零吸光度)“0%T键：用于自动调整零透射比键：用于自动调整零透射比“波长设置旋钮：用于设置分析波长波长设置旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作样品测试操作 翻开电源开关，使仪器预热翻开电源开关，使仪器预热20分钟分钟 用用“波长设置按钮将波长设置在您将要运用的分析波长波长设置按钮将波长设置在您将要运用的分析波长位置上位置上 翻开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉翻开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路入光路 盖好样品室盖，按盖好样品室盖，按“0%T键调透射比零键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T调调100%透射透射比比 按按“方式键方式键MODE将测试方式设置为吸光度方式将测试方式设置为吸光度方式(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 翻开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比