(暨实验方剂学改革探讨)

1、蛋白质组学-方证研究的新思路（暨实验方剂学改革探讨）沈芸上海中医药大学（上海 201203）关键词：蛋白质组学 方证 一蛋白质组学的发展和应用 分子生物学在最近20 年中经历了革命性的发展,目前已有50 多种生物的基因组序列被测定完毕,生命科学的研已有50 多种生物的基因组序列被测定完毕,生命科学的研列还不能了解基因的全部内含,只有直接研究蛋白质在特定条件下的表达情况,才能更深入地了解蛋白质的表达、分布、加工修饰及相互作用等信息,也才能更深入地了解各种生命现象的机制。同时，基因组的研究已经极大的促进了疾病机制的研究及药物的研究与开发, 基因治疗及基因工程药物在近几年内得到了飞速发展,但疾病的发

2、生及治疗主要发生在蛋白质水平,仅仅依据基因的信息在很多时候还不能有效的开发新型药物和完全解释药物在生物体内的作用机制,研究细胞中蛋白质的表达不仅有助于药物的开发及疾病的治疗，。 1994 年澳大利亚的Wilkins 和Williams 首先提出了蛋白质组(proteome) 的概念:即基因组表达的全部蛋白质,或指细胞、组织或机体在特定时间和空间所表达的所有蛋白质。由于蛋白质表达随机体生理状态的改变而改变,细胞内的蛋白质组应该是动态的。比较患病细胞与正常细胞中蛋白质的表达变化,或者比较患病细胞与药物处理后的细胞中蛋白，的表达变化,有可能发现一些新的药物靶点及药物。在随后的几年中,蛋白质组学在疾病

3、机制的研究及药物开发中将占有越来越重要的作用。在新药研究中，蛋白质组学可以提供细胞或组织中蛋白质的表达丰度,通过比较病态与正常态时细胞内蛋白质表达的差异,有可能找到有效的药物或者是药物靶点。同时，通过比较正常细胞、病态细胞及药物处理后的病态细胞的蛋白表达丰度的变化,也可以分析药物候选者的潜在作用。例如,应用二维凝胶电泳技术分析调血脂药物洛伐他汀作用后的蛋白质表达结果,表明洛伐他汀影响了与胆固醇代谢相关的一些蛋白质的表达，从而更加明确其药理作用。蛋白质组学的另一应用就是研究药物的毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化可以提示药物的毒性作用机制。Steiner 等利用二维凝胶电

4、泳研究了环孢素A(cyclosporin A CsA) 对小鼠肾脏的毒性。比较正常状态与CsA 作用后的肾脏蛋白的二维凝胶图谱。结果发现,在CsA 作用后的肾脏蛋白二维凝胶图谱中发现了一个特异蛋白质,经鉴定为钙结合蛋白(calbindin) ,这种蛋白质存在于肾小管中,参与钙离子的结合及转运。现在已经证明CsA 的毒性在于与小管内钙化有关,而导致钙结合蛋白不能降解。 蛋白质组的研究流程大体可分为分离、鉴定、分析三步。即先从组织或细胞中提取蛋白质,进行双向电泳以实现蛋白质的分离;然后进行蛋白质样品显色,切下待分析的蛋白质斑点,用胰蛋白酶胶内消化;接着,对消化后得到的多肽片段进行生物质谱分析测定,

5、得到肽质量指纹图谱;最后,数据库检索对蛋白质进行鉴定及功能分析。涉及到双向凝胶电脉、质谱和生物信息学的应用。二将蛋白质组学运用于方证研究和实验方剂学目前，中医药的客观化/现代化是中医药能否走向国际，能否作到国际化的瓶颈问题之一。运用的现代科学的研究手段验证和阐明方剂的配伍原则和作用原理，探讨方证的关系亦是十分重要的课题。中医药现代化的进程已经走了进20年，其中有经验也有教训，但客观的说，作为一门学科，它越来越成熟了。不仅能更快更好地运用最新的科技手段和方法，同时重要的是，能理性地，客观地使用这些研究方法，将中医辨证论治的思维精髓用于研究的指导思想中，真正作到科学运用。“证”是中医辨证的基础，也

6、是中医的精华所在，而方剂则是临床辨证论治的产物，任何一首方剂的产生都是以辨证为依据的，是针对具体病证作出的针对性治疗用药方案。中医的证候是疾病过程中某一阶段机体对内外致病因素的综合反应,在宏观上表现为特定的症状、体征及舌脉的组合;证候具有整体性,包括了体质特征、脏腑经络气血、阴阳等的失衡及相互间的关系,它反映了疾病的病因、病机及正邪斗争的概括和趋势;证候具有时相性,即动态变化的特点。中医学非常重视人体的统一性和完整性及其与自然界的相互关系。构成人体的各个组成部分之间,在结构上是不可分割的,在功能上是相互协调、相互为用的,在病理上是相影响的。中医的证候是宏观、综合性的全身评价,同时又是复杂的。证

7、候的这个特点大大增加了研究的难度与复杂性。目前的部分研究结果认为，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的发生发展的动态变化过程，是在证的发生发展过程中产生的特殊物质（群）。这其实是一个相当含糊的解释，难免给研究者带来困惑。利用方证相应/方证结合的方法不仅为寻找证的物质基础带来新的研究途径，也为多层面阐释方剂作用原理提供了客观介质。但由于中药方剂一般由多味中药组成，其组成成分复杂，药理作用又是多靶点，多环节，多层次的整体性调节方式，对机体各个组织器官都有着广泛的调节作用。虽然知道方剂进入体内发挥其药理作用过程所纠正的物质应是存在于机体个组织器官的蛋白质，但由于其中存在药

8、物分子与生物体内蛋白质复杂的直接或间接的相互作用，以往的蛋白质研究技术确实很难加以研究，而蛋白质组学研究技术的出现为方证客观化研究提供了一个可操作的平台。有学者提出“证候基因组学(zhenghou genomics) ”、“证候蛋白质组学( zhenghou pro teomics) ”,试图在分子水平描绘中医证候本质的全貌。利用蛋白质组的双向凝胶电泳，能有效分离蛋白质，其第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离, 第二向则按分子量的不同用SDS PAGE 分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。现在, 双向凝胶电泳的一块胶板(16cm ×20cm) 可分出3 , 000

9、4 ,000 个、甚至10 ,000 个可检测的蛋白斑点。换句话说，它可以同时分辨生物体的某一组织或细胞中的上万种蛋白。同时利用的质谱技术快速而准确地鉴定出这些蛋白质。 根据以上技术，有人方证研究提出这样的研究路线，根据方证相应的原理，首先制造出某一证候的动物模型，给该证候的模型相应的经典方剂治疗后，利用蛋白质组学的方法观察相关组织的表达差异蛋白。将不同状态下不同动物的双向电泳图谱相互比较，得到的表达差异蛋白的信息可以提示：1.证本质蛋白质，即机体在出现该证时异常表达的蛋白；2. 中药和造摸方法造成的异常表达蛋白；3.中药方剂作用后表达的蛋白；这样的的话，不仅能同时观察机体在出现某证时复杂的蛋

10、白变化，还能排除实验操作时由于造模药物和中药不良反应引起的表达差异蛋白质，从而是结果更客观，更可靠。实时多层面，多角度的观察机体蛋白质变化，对于方剂复杂的作用靶点来说，显得更实效。以往的方剂作用机制实验利用Weston技术，每块胶一次观察少数几个蛋白的变化，为了全面阐释复方作用机理，往往需要多次重复不同的实验以得到所需数据。将蛋白质组的多系统研究方法运用于实验方剂学的意义和优势也在于此，作为一项新技术，它能带给学生更多的知识和信息，同时激发学生更浓厚的研究兴趣，充分培养其动手能力。一个完整的方证研究/蛋白质组学实验对于准确揭示方剂对机体产生的作用和作用机理是几个类似的简单的方剂学实验都不能达到的。三存在的问题和解决办法由于蛋白质组学研究对实验室和研究人员的要求较高，同时其实验试剂和相应的质谱技术较为昂贵，需要大量的资金支持才能开展和保证正常运转。所以蛋白质组学在方证研究中的应用难以在各个高等院校普遍开展。同时由于该技术开展的时间并不长，势必在研究过程中存在重复性和稳定性的问题，而对于方证体系这样一个多系统，多器官并处于动态变化过程中的体系，怎样运用蛋白质组学深入阐释，确实任重道远。但中医药研究需要发展，需要运用一些可能现代科技手段，以揭示其奥妙的内在机理，