细胞因子检测技术课件

1、细胞因子检测技术第一页，共三十三页。细胞因子检测技术细胞因子细胞因子（cytokine, CK）指由免疫细胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成与分泌(fnm)的，具有多种生物功能的小分子蛋白质的统称。因能调节多种细胞的生理功能而得名。可介导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。细胞因子一、细胞因子概述一、细胞因子概述(i sh)第二页，共三十三页。细胞因子检测技术以生物学作用进行以生物学作用进行(jnxng)划分的分类划分的分类白细胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干扰素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-

2、肿瘤坏死(hui s)因子（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor） TGF- 趋化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF第三页，共三十三页。细胞因子检测技术 细胞因子间的相互作用细胞因子间的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 T

3、GFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN内皮细胞成纤维细胞TB第四页，共三十三页。细胞因子检测技术 二、二、 细胞因子检测细胞因子检测(jin c)(jin c)的方法与原理的方法与原理（一）细胞(xbo)生物学检测（二）免疫学检测（三）分子生物学检测第五页，共三十三页。细胞因子检测技术1、细胞

4、增殖或增殖抑制(yzh)试验2、细胞毒活性测定3、抗病毒活性测定法4、细胞趋化活性测定法（一）细胞（一）细胞(xbo)生物学检测生物学检测第六页，共三十三页。细胞因子检测技术1、细胞、细胞(xbo)增殖和增殖抑制测定法增殖和增殖抑制测定法 以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制察特定的细胞因子刺激或抑制(yzh)依赖性依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。 常用的检测细胞增殖的方法有常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺掺入法、比色法、染色法和直接计数法入法、比色法、染色法和直接计数法等。等。

5、其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括色法包括 MTT、XTT、MTS和和NAG等等方方法。法。第七页，共三十三页。细胞因子检测技术 通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记苷标记(bioj)(bioj)上可以示踪的同位素（上可以示踪的同位素（3 3H/H/125125I I ），通过检测细胞内的同位素），通过检测细胞内的

6、同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。含量，则可反映细胞增殖的程度。结果结果(ji gu)(ji gu)客观易于自动化；客观易于自动化；适用于大标本量的测定适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染株影响；放射性污染(1) (1) 放射性核素掺入法放射性核素掺入法第八页，共三十三页。细胞因子检测技术特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化以细胞代谢变化(binhu)(binhu)为增殖指征为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定测定(cdng)(cdng)步骤步骤类似类似与同位

7、素掺入法相比与同位素掺入法相比(xin b)掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、 培培养时间不同养时间不同(2) MTT (2) MTT 比色法比色法第九页，共三十三页。细胞因子检测技术2、细胞毒活性测定(cdng) 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为为(

8、zuwi)判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂比。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为量关系的标准曲线，以此作为(zuwi)待测品活性的定量待测品活性的定量测定的基础。测定的基础。 本法常用本法常用(chn yn)于于TNF等的测定等的测定第十页，共三十三页。细胞因子检测技术Wish、Hep2/c 人干扰素人干扰素L929 小鼠干扰素小鼠干扰素Ratec 大鼠干扰素大鼠干扰素A549MDBK 多种族多种族(zhngz)的的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNI

9、FN等的测定等的测定，IFNIFN可诱导细胞可诱导细胞(xbo)(xbo)产生抑制产生抑制病毒病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保护细胞合成的酶，保护细胞(xbo)(xbo)不受病毒感染，产生不受病毒感染，产生细胞细胞(xbo)(xbo)病变效应（病变效应（CPECPE）。）。 VSV、EMCV及及Sindbis virus等等细胞病变效应细胞病变效应(CPE)、抑制病毒抑制病毒(bngd)蚀斑形成或抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒(bngd)的产量的产量3 3、抗病毒活性测定法、抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒常用于攻击细胞的病毒

10、检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法第十一页，共三十三页。细胞因子检测技术趋化性趋化性(chemotaxis)(chemotaxis)： 诱导细胞向由诱导细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作定向移动的趋化因子高浓度处作定向移动的特性特性, ,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验(shyn)(shyn)。化学增活性化学增活性(chemokinesis)(chemokinesis)： 细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性, ,可采用琼脂糖可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导

11、趋化因子诱导(yudo)(yudo)细胞移动的方式细胞移动的方式4 4、趋化活性测定法、趋化活性测定法第十二页，共三十三页。细胞因子检测技术滤膜：计数(j sh)受趋化细胞趋化因子细胞(xbo)趋化试验原理趋化试验原理(yunl)示示意意第十三页，共三十三页。细胞因子检测技术靶细胞的选择靶细胞的选择(xunz)与培养与培养1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存(bocn)、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配第十四页，共三十三页。细胞因子检测技术各类细胞因子检测各类细胞因子检测(jin c)的常用靶细的常用靶细胞胞细胞因子 实验(shyn)系统 干扰因素IL-1 D10（

12、M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4第十五页，共三十三页。细胞因子检测技术各类细胞因子检测各类细胞因子检测(jin c)的常用靶细胞的常用靶细胞细胞因子 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性(zhngxng)粒细胞（

13、M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN- 、 IFN- L929（M）病变保护法 IFN- 、 IFN- 第十六页，共三十三页。细胞因子检测技术敏感性较高敏感性较高特异性不高特异性不高操作操作(cozu)(cozu)繁琐繁琐易受干扰易受干扰生物学活性测定方法学评价生物学活性测定方法学评价(pngji)(pngji)第十七页，共三十三页。细胞因子检测技术（二）免疫学检测（二）免疫学检测(jin c)细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体( 单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通

14、过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示， 从而定性(dng xng)或定量显示细胞因子(或受体)的水平。1、ELISA法2、酶联免疫斑点实验3、流式细胞分析法第十八页，共三十三页。细胞因子检测技术1 1、ELISAELISA方法方法(fngf)(fngf)ELISAELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISAELISA的基本步骤的基本步骤(bzhu)(bzhu)，可作定性或定量分析。可作定性或定量分析。ELISAELISA法不仅可以用于细胞因子检测

15、，也法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定 第十九页，共三十三页。细胞因子检测技术敏感性偏低敏感性偏低不能判断不能判断(pndun)(pndun)细胞因子的生物学活性。细胞因子的生物学活性。ELISAELISA特异、简便特异、简便易于推广和标准化等优点易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定细胞因子测定(cdng)(cdng)的首选方法的首选方法第二十页，共三十三页。细胞因子检测技术2 2、酶联免疫斑点试验、酶联免疫斑点试验(shyn)(sh

16、yn)(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot) ElisaSpot) 在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获上的特异性抗体捕获(bhu)(bhu)。后续的反应如同。后续的反应如同ELISAELISA，即，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。别作

17、直接或间接法。 一个斑点一个斑点(bndin)(bndin)代表一个细胞因子分泌细胞，代表一个细胞因子分泌细胞，斑点斑点(bndin)(bndin)的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关因子量相关 基基本本原原理理第二十一页，共三十三页。细胞因子检测技术ELISPOT第二十二页，共三十三页。细胞因子检测技术3 3、流式细胞分析法、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细

18、胞因子和细胞表面粘附分子分子(fnz)(fnz)的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子胞因子和膜分子(fnz)(fnz)的表达情况。的表达情况。 1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2 2细胞固定细胞固定(gdng)(gdng) 3 3封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点 4 4染色与分析染色与分析 基本基本(jbn)步骤步骤第二十三页，共三十三页。细胞因子检测技术细胞细胞(xbo

19、)内细胞内细胞(xbo)因子检测技术因子检测技术激活(j hu)膜抗原(kngyun)标记细胞内细胞因子标记第二十四页，共三十三页。细胞因子检测技术使用使用(shyng)(shyng)流式细胞分析法，可以：流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1Th1细胞细胞 IFN-IFN- Th2 Th2细胞细胞 IL-4IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合无需作细胞固定和非特异性结合(jih)(jih)位点的封闭位

20、点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态第二十五页，共三十三页。细胞因子检测技术免疫学测定方法学评价免疫学测定方法学评价(pngji)(pngji)优点：优点： 特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制影响因素较少且易控制(kngzh)(kngzh)，重复性好，方法容易标准化。，重复性好，方法容易标准化。缺点：缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系结果

21、与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合子的结合第二十六页，共三十三页。细胞因子检测技术（三）分子生物学检测（三）分子生物学检测(jin c) 此方法测定此方法测定(cdng)的并非细胞因子本身，而是细胞的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。因子的基因。方法：方法： 1、Northern印迹杂交法印迹杂交法 2、Southern 印迹杂交法印迹杂交法 3、PCR与逆转录与逆转录PCR 4、原位杂交，原位、原位杂交，原位PCR和原位和原位RTPCR 第二十七页，共三十三页。细胞因子检测技术 三、常用三、常用