细胞培养液的配制ppt课件

1、细胞培育液的配制 培育基的选择 根据: 阅历、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM 培育基的来源 市售干粉培育基-本人配制 液体培育基-直接运用(留意有效期) 培育基的除菌方法 过滤除菌: (1) 正压过滤-效率高 (2) 负压过滤-效率低 高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培育基附加成分的添加 按运用阐明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等 RPMI1640培育液配制过程 预备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45m,0.22m),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培育粉,1N

2、 HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新颖三蒸水 消毒物品 滤器中放置0.45m和0.22m滤膜, 包装, 高压蒸气消毒配制步骤 (1) 10.4g/(1) 10.4g/包培育粉溶至包培育粉溶至1L1L三蒸水中三蒸水中, , 磁力搅磁力搅拌拌20min20min(2) (2) 加加2g NaHCO3/L, 2g NaHCO3/L, 继续搅拌继续搅拌10min10min(3) (3) 加青霉素加青霉素100U/mL(80100U/mL(80万万U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml) 链霉素链霉素100U/mL(100100U/mL(100万万U U

3、溶至溶至5ml5ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml)(4) (4) 加加1N HCl1N HCl约约3mL, 3mL, 调调pHpH至至7.2, 7.2, 继续搅拌继续搅拌(5) (5) 按要求加血清血清普通需经按要求加血清血清普通需经5656，30min30min灭活灭活 例如例如: 10%: 10%胎牛血清胎牛血清 无血清培育液无血清培育液 900ml 900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清 100ml 100ml(6) (6) 正压过滤除菌正压过滤除菌 ( (气压适当气压适当, , 防止滤膜破裂防止滤膜破裂) )(7) (7) 分装分装, ,储存于储存于44，2 2周内用完

4、。周内用完。(8) (8) 无菌实验无菌实验: : 取样取样, 37, 37放置放置242472h, 72h, 无细无细菌、霉菌污染方可运用菌、霉菌污染方可运用本卷须知 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，谷氨酰胺在溶液中很不稳定，分解，分解，放置两周以上时，根据需求添加谷氨酰胺。，放置两周以上时，根据需求添加谷氨酰胺。配制配制母液母液200 mmol/L, 200 mmol/L, 即即29.22g/L29.22g/L, , 每每100ml100ml参与参与0.50.52 ml2 ml母液，终浓度母液，终浓度1 14 4 mmol/L mmol/L 抗生素在抗生素在3737稳定性维持稳定性维持3 34d

5、, 4d, 可控制轻度污可控制轻度污染。防污染重在无菌操作染。防污染重在无菌操作 培育液配制过程 以RPMI1640为例1. 物品预备(1滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。 (2) (2) 培育粉、培育粉、 NaHCO3 NaHCO3、 1N HCl1N HCl、青霉素、链霉、青霉素、链霉素、血清、新颖制备的素、血清、新颖制备的三蒸水三蒸水取孔径为取孔径为0.45m0.45m和和0.22m0.22m滤膜各一张，浸入三蒸水中滤膜各一张，浸入三蒸水中 将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒将装有滤膜

6、的滤器包装后高压蒸气消毒 将培育粉倒入容器中将培育粉倒入容器中参与新颖制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌参与新颖制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌按照实验的详细要求分别参与按照实验的详细要求分别参与 NaHCO3 NaHCO3和青链霉素和青链霉素青霉素青霉素100U/mL100U/mL：8080万万U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml0.5ml； 链霉素链霉素100U/mL100U/mL：100100万万U U溶至溶至5ml5ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml)按要求参与一定比例的按要求参与一定比例的血清血清普通需经血清血清普通需经5656，30min30min灭活灭活 例如例如: : 配制含配制含10%10%胎牛血胎牛血清的清的RPMI1640RPMI1640培育液培育液1 1升，应参与升，应参与 无血清培育液无血清培育液900ml900ml 灭活胎牛血清灭活胎牛血清100ml100ml参与参与1N HCl1N HCl约约3mL,3mL,调整调整pHpH至至7.27.27.47.4磁力搅拌器充分磁力搅拌器充分搅拌搅拌预备过滤预备过滤 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道能否通畅。无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道能否通畅。 ( (普通运用氧气。留意气压适当普通运用氧气。留意气压适当, , 防止滤膜破裂，防止滤膜破裂，)