实验一、RNA提取及检测ppt课件

1、实验实验 一、一、RNA提取及检测提取及检测一、实验目的一、实验目的掌握植物掌握植物RNA RNARNA RNA提取及检测方法提取及检测方法二、实验试剂及材料二、实验试剂及材料水稻叶片、液氮、水稻叶片、液氮、TrizolTrizol试剂、氯仿、异试剂、氯仿、异丙醇、丙醇、DEPCDEPC水水三、实验器材三、实验器材恒温水浴锅、恒温水浴锅、PCRPCR仪、台式低温离心机、仪、台式低温离心机、移液枪、研钵、紫外分光光度计，一次性移液枪、研钵、紫外分光光度计，一次性手套。手套。 四、实验步骤四、实验步骤 采用采用TrizolTrizol法提取法提取RNA(50RNA(50100mg100mg组织组织

2、ml trizol)ml trizol)，以加，以加1ml Trizol1ml Trizol为例，操为例，操作流程如下：作流程如下：(1) (1) 研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。加入研磨至粉末。加入TrizolTrizol每每100mg100mg组织加组织加1ml1ml的的TrizolTrizol），充分研磨，放在室温下解），充分研磨，放在室温下解冻。冻。(2) (2) 除不溶性物质：除不溶性物质：2 28C8C下下12000g12000g离心离心10min10min，不溶性物质沉淀，将，不溶性物质沉淀，将RNARNA的上清移入的上清移入1.5

3、 ml1.5 ml离心管中。离心管中。(3)(3)相分离：在相分离：在15153030下放置下放置5min5min，使核，使核蛋白复合物完全解离。加蛋白复合物完全解离。加0.2ml0.2ml氯仿，剧烈氯仿，剧烈振荡振荡15 sec15 sec，室温下温浴，室温下温浴2 23min3min。2 288下，下，12000g12000g离心离心15min15min，RNARNA全部溶解于全部溶解于上层水相中，把水相移入另一上层水相中，把水相移入另一1.5ml1.5ml离心管离心管中。中。 (4) 氯仿再次去杂：加0.5ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温下温浴23min；28下，12000g离心15m

4、in，把水相转入1.5ml离心管中。(5) RNA沉积：加入0.5ml异丙醇，1530温浴10min；2-8下，12000g离心10min，RNA沉积在离心管的底部及侧壁。(6)清洗RNA：加入1ml 75%乙醇，28下7500g离心5min，小心将上清液倒掉。(7)再清洗：加入1ml 75%乙醇，28下，7500g离心5min，小心将上清液倒掉。(8)RNA的溶解：将离心管倒扣在吸水纸上510min，每管加30l的DEPC水，可在5560下助溶10min。(9)RNA浓度：用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度计 测定OD值260nm、280nm 230nm），估算RNA浓度。-70 保管

5、。总RNA定量方法 RNA在260nm波长处有最大吸收峰。OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNAmg/ml）=40OD260读数稀释倍数(n)/1000RNARNA浓度检测过程浓度检测过程（1 1取少量待测取少量待测RNARNA样品，用样品，用DEPC DEPC 水稀释水稀释100100倍。倍。（2 2用用DEPC DEPC 水做空白，在水做空白，在260 nm260 nm、280 nm280 nm、230 nm230 nm处调节紫外分光光度计的读数至零

6、。处调节紫外分光光度计的读数至零。（3 3加入待测加入待测RNARNA样品在三个波长处读取样品在三个波长处读取ODOD值。值。 RNA RNA纯品的纯品的OD260/OD280OD260/OD280的比值为的比值为2.02.0，故根据，故根据OD260/OD280OD260/OD280的比值可以估计的比值可以估计RNARNA的纯度。若比值较低，的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNARNA有降有降解。解。 OD260/OD230 OD260/OD230比值应比值应 2.0 2.0，若比值较低说明盐，若比值较低说明盐分过高。分过高。电

7、泳检测电泳检测RNARNA质量：质量：（1 1配制配制1.2%1.2%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶20mL20mL）称取琼脂糖称取琼脂糖0.24 g0.24 g，加，加DEPCDEPC处理的处理的ddH2O 12.04 mLddH2O 12.04 mL，5 5RNA RNA 电泳缓冲液电泳缓冲液4 mL4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却，电炉加热融化琼脂糖，冷却至至5555C C，加入甲醛，加入甲醛1.96 mL1.96 mL，冷却后倒胶。，冷却后倒胶。（2 2RNARNA电泳电泳取去离子甲酰胺取去离子甲酰胺10 L10 L，甲醛，甲醛1.5 L1.5 L，1010 RNA RNA Buffer

8、2 LBuffer 2 L，RNA (2RNA (24 g, 10 L)4 g, 10 L)混合液，混合液，6565C C加热加热15min15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 3 L RNA L RNA 加样缓冲液和加样缓冲液和0.5 L EB0.5 L EB，上样电泳。电泳，上样电泳。电泳Buffer Buffer 为为1 1 RNA buffer RNA buffer。（2RNA电泳结果判别质量： 出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNArRNA分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数

9、细胞中的信使RNAmRNA经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28SrRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。五、总五、总RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析vRNA降解降解v1、外源、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环酶的污染：试剂，器械及实验环境中的境中的RNA酶进入实验系统。酶进入实验系统。v2、内源、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。v3、外源性污染也可以排除，那么降解几乎都、外源性污染也可以排除，那么

10、降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。样冰箱中。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷。以研磨用具必须

11、预冷。OD260/OD280比值偏低1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD26

12、0读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。vRNA提取得率低提取得率低1. 该组织或者细胞中该组织或者细胞中RNA含量偏低：含量偏低：v 不同细胞和组织中不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织等是高丰度组织(总总RNA含量含量2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织胸腺，卵巢等是中丰度组织(总总RNA含量含量0.05-2g/mg)，膀胱，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织骨，脂肪等是低丰度组织(总总RNA含量含量0.05g/mg)。2. 组织起始量太少或者太多：组织起始量太少或者太多：v 样品量过少，则细胞组织中样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得得率低。率低。v六、本卷须知：六、本卷须知