第三章高效液相色谱ppt课件

1、高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatographyHPLC高效液相色谱法高效液相色谱法一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、固定相和流动相三、固定相和流动相四、主要分离类型四、主要分离类型五、影响分离的因素五、影响分离的因素高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法GCHPLC流动相流动相惰性气体无亲和性，只惰性气体无亲和性，只起运载作用）起运载作用）气体、沸点较低的化合物气体、沸点较低的化合物不同

2、极性的液体有一不同极性的液体有一定亲和作用）定亲和作用）温温 度度 较较 高高一般室温一般室温分析对象分析对象高沸点、不稳定的天高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、然产物、生物大分子、高分子化合物高分子化合物GC与与HPLC比较比较分配色谱分离原理SiSiOOOHClSiSiOOHOHCl Si(CH3)2RSiSiOOOSi(CH3)2RSi(CH3)2RR - 极性基团极性基团 疏水基团疏水基团 离子交换基团离子交换基团OHOH正相HPLCnormal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性或弱极性流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相

3、是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLCreversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODSOcta Decyltrichloro Silane)固定相性质固定相性质极性极性非极性非极性键合基团键合基团 极性基团极性基团疏水基团疏水基团流动相性质流动相性质非极性非极性极性极性出峰顺序出峰顺序 极性小先出极性小先出 极性大先出极性大先出吸附色谱法吸附色谱法 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是

4、510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 固定相为离子交换树脂，固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱流动相为无机酸或无机碱的水溶液。的水溶液。 各种离子根据它们与树脂上的交换各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。基团的交换能力的不同而得到分离。根据样品分子尺寸大小分离根据样品分子尺寸大小分离 大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。排阻色谱法排阻色谱法(凝胶色谱法凝胶色谱法)1. 1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（

5、凝胶过滤色谱）聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2. 2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠凝胶渗透色谱）半硬凝胶：聚苯乙烯珠凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色尺寸，（高效排阻色 谱）谱） 流动液贮存提供脱气流动液贮存提供脱气 输液泵输液泵 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 控制与记录系统控制与记录系统 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高压输液泵：高压输液泵：高压输液泵是液相色谱仪的关键部高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流件，其作

6、用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。果的重复性和准确性。 活塞泵 注射泵 气动泵进样系统进样系统色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱泵泵泵泵12进进样样 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀通常使用所谓六通阀进样系统进样系统色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。特性、填充质量和使

7、用条件有关。 检测器检测器 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外紫外- -可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器质谱检测器质谱检测器v 单波长单波长UVUV检测器，光源用检测器，光源用HgHg灯，加滤光灯，加滤光片可以到片可以到254254，280280，313313，334334，365365等。等。生化中用到很多。生化中用到很多。v 多波长多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光光度计类似，光栅或棱镜分光A AlglgI0/It)= b cI0/It)= b c紫外紫外- -可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测

8、器许多有机化合物，特别是芳香许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。反应衍生化后检测。 特点：特点： 有非常高的灵敏度和良好有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法的选择性，灵敏度要比紫外检测法高高2 23 3个数量级，特别适合于药物个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。和生物化学样品的分析。荧光检测器结构示意图荧光检测器结构示意图光源光源检测器检测器滤光片滤光片检测室检测室蒸发光散射检测器蒸

9、发光散射检测器蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。电活性和不发荧光的样品的检测。电化学检测器电化学检测器（以电导检测器为例）（以电导检测器为例）电导仪电导仪电极电极电极电极四种色谱分离模式的分离机理及应用范围四种色谱分离模式的分离机理及应用范围反相色谱的概念反相色谱的概念高效液相色谱应用实例高效液相色谱应用实例 柱后pH调节电导检测对有机酸具有高选择性和高灵敏度对有机酸具有高选择性和高灵敏度有机酸分析系统流程图有机酸分析系统流程图2348756 91011、2 泵 3 进样器 4 柱温箱 5 电导检测器 6 数据处理机 7 混合

10、室 8 柱子 9 流动相 10 缓冲液分析条件分析条件分离条件分离条件 色谱柱：色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D300mmL.) 1个或个或2个分析柱连接个分析柱连接 保护柱保护柱 SCR-102H (6mmI.D.50mmL.)流动相：流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液甲苯亚磺酸水溶液流量流量 ：0.8mL/min温度温度 ：40或或45检测条件检测条件缓冲液：缓冲液：20mM Bis-tris 水溶液水溶液 含含 5mM p-甲苯亚磺酸和甲苯亚磺酸和100 EDTA流量流量 ：0.8mL/min检测器：电导检测器检测器：电导检测器 polarity;+ 样品的分

11、析实例样品的分析实例食品食品啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等体液体液血清，尿等血清，尿等医药品医药品肾的透析液，钙制剂等肾的透析液，钙制剂等发酵发酵微生物培养液，酸奶等微生物培养液，酸奶等环境环境工厂废水等工厂废水等有机酸标准品的色谱图有机酸标准品的色谱图1 1一个分析柱一个分析柱 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 乙酰丙酸乙酰丙酸10. 10. 焦谷氨酸焦谷氨酸啤酒的色谱图啤酒的色谱图 1. 1. 磷酸磷

12、酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 焦谷氨酸焦谷氨酸10. 10. 碳酸碳酸前处理前处理振荡除去碳酸气后，振荡除去碳酸气后，过滤过滤1010进样进样清酒的色谱图清酒的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 乙酸乙酸 8. 8. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1010min.葡萄酒的色谱图葡萄酒的色谱

13、图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3 . 3 . 酒石酸酒石酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理用水稀释用水稀释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 min. 酱油的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠酸柠酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 苹果酸苹果酸 5. 5. 琥珀酸琥珀酸 6. 6. 乳酸乳酸 7. 7. 甲酸甲酸 8. 8. 乙酸乙酸 9. 9. 乙酰丙酸乙酰丙酸10. 10. 焦谷氨酸焦谷氨酸前处理前处理用水稀释用水稀

14、释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 血清的色谱图血清的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 丙酮酸丙酮酸 4. 4. 乳酸乳酸 5. 5. 甲酸甲酸 6. 6. 乙酸乙酸 7. 7. 焦谷氨酸焦谷氨酸 8. 8. 未知物未知物前处理前处理加高氯酸用离心法去沉淀物，取上清加高氯酸用离心法去沉淀物，取上清液液5uL5uL进样进样尿样的色谱图尿样的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 乳酸乳酸 4. 4. 甲酸甲酸 5. 5. 未知物未知物 6. 6. 焦谷氨酸焦谷氨酸 7 7 未知物未知物前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1

15、010酸奶的色谱图酸奶的色谱图 1. 1. 磷酸磷酸 2. 2. 柠檬酸柠檬酸 3. 3. 琥珀酸琥珀酸 4. 4. 乳酸乳酸 5. 5. 甲酸甲酸 6. 6. 乙酸乙酸前处理前处理用水稀释用水稀释1010倍后过滤倍后过滤进样量进样量1010 工厂废水的色谱图工厂废水的色谱图 1. 1. 甲酸甲酸 2. 2. 乙酸乙酸 3. 3. 丙酸丙酸 4. 4. 碳酸碳酸 5. 5. 丁酸丁酸 6. 6. 戊酸戊酸前处理前处理过滤后，进样过滤后，进样1010食品安全是所有国家的每个消费者关心的基本问题。残留农药和兽药是食品中主要的污染物世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是在美国、加拿大、欧盟以及日

16、本食品安全法规更加严格的完善。在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的检测中非常苛刻的。食品安全与污染物食品安全与污染物 农产品农产品- 谷物：大米等谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜甘蓝）、菠菜等蔬菜：洋白菜甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。茶叶，种子，蜂蜜等。食品中残留检测食品中残留检测 审查农药残留审查农药残留 家畜及水产品家畜及水产品- 牛肉，猪肉等牛肉，猪肉等 - 鸡肉、鹌鹑等鸡肉、鹌鹑等 - 鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等 - 虾，对虾虾，对

17、虾审查兽药残留审查兽药残留全世界使用的农药超过700种：杀虫剂，除草剂，杀菌剂，脱叶剂，植物生长调节剂。残留：残存在农产品中的农药降解缓慢及其代谢物由以下原因所致： - 使用更稳定的化学物质作农药。 - 农药的过度使用以及不合理使用。最大残留限量(MRL)：食品安全的指标，通常MRL0.01-0.05mg/kg(ppm)食品中的农药残留食品中的农药残留农药的残留农药的残留1） 有机氯化物：有机氯化物：硫丹、荚蟥醚、克菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、硫丹、荚蟥醚、克菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄溴螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄氏剂、六氯苯、七氯氏剂、

18、六氯苯、七氯 有机磷化物：有机磷化物： 苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，敌敌畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，敌敌畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，丰索磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马丰索磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马拉硫磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，拉硫磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷，甲拌磷甲拌磷 氨基甲酸酯：氨

19、基甲酸酯：灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，丁威，残杀威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹禾草丹 拟除虫菊酯拟除虫菊酯氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯菊酯 含氮化合物：含氮化合物： 甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙环唑，联三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺

20、，丙环唑，联苯三唑醇，灭锈胺，灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，苯三唑醇，灭锈胺，灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，敌稗，二甲戊灵，氟乐灵，多效唑。敌稗，二甲戊灵，氟乐灵，多效唑。农药的残留农药的残留2）在过去几年中，相关法规已完成或修订，控制程度更加严格。在欧盟和美国已建立起完整的监测网络参考实验室；参考材料及标准；计算机监视小组等）在样品净化，色谱分离和检测中使用改进的和新的分析技术及方法，如GC/MS和LC/MS，就会产生更灵敏，更准确和更可靠的结果。公众比以前更加关注食品安全。欧盟和美国现在的形势欧盟和美国现在的形势 灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜

21、威，仲丁威，残杀威，恶虫威，克百威威，残杀威，恶虫威，克百威 ( (呋喃丹呋喃丹),),速灭威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹乙霉威，氯丙嗪，禾草丹 氨基甲酸酯类农药丁醛肟威草肟威呋喃丹CPMC残杀威（PHC，Arprocarb）苯噁威二甲杀威（MPMC）乙硫甲威灭定威甲萘威（NAC）XMC苯氧丁威（BPMC）甲硫威（Mercaptodimethur）异丙威（MIPC）乙肟威甲氧威（MTMC）氨基甲酸酯类农药结构氨基甲酸酯类农药结构N-N-甲基氨基甲酸酯的甲基氨基甲酸酯的HPLCHPLC分析方法流程图分析方法流程图 1、脱气装置 10、反应试剂输液机构 2、低压梯度装置 11、混合装置3、流动

22、相输液机构 12、荧光检测器4、梯度混合器 13、阻尼盘管 5、自动进样器 14、反应盘管6、柱温箱 15、反应盘管7、分析柱 M1，M2：流动相8、化学反应箱 R1，R2：反应试剂液9、脱气装置N-N-甲基氨基甲酸酯的甲基氨基甲酸酯的HPLCHPLC分析方法分析方法 N-氨基甲酸甲酯类农药的基本化学结构式它们的化合物在碱的条件下加水分解生成甲胺。这里生成的甲胺与一级胺的荧化衍生化试剂O-苯二甲醛OPA反响，可进行较高灵敏度的荧光检测。 氨基甲酸酯前处理过程氨基甲酸酯前处理过程8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图 1994年6月9日官报上登载的成分的分析例 1616成分的成分的N-N-氨基甲酸甲酯类农药标准氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图试样同时分析的色谱图甲硫威及其代谢物甲硫威及其代谢物甲硫威代谢物高灵敏度分析例 （例如在橘子汁中不得含50ppb以上） 甲硫威的检测限S/N=3为2ppb 离子色谱离子色谱离子色谱过渡金属分析系统C