w03细胞生物学研究方法

1、l第三章 细胞生物学研究方法 一、细胞形态结构观察（一）光学显微镜：l1、普通光镜的性能指标：放大率（放大倍数）分辨力、清晰度、焦点深度、镜象亮度。l 分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力，通常是以分辨距离来表示的，即分辨距离越小则分辨力越高。 图2-1 尼康E-600 显微镜l 人肉眼分辨力测试是规定在明视距离25cm所分辨的最短间距来表示，正常人肉眼分辨力的极限值是0.1mm(毫米)，显微镜的分辨力可按下列公式来计算 R=0.61/N.A （R 是分辨距离，0.61是常数， 是照明光波波长，NA是显微镜物镜的镜口率光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。l

2、l 分辨距离R与镜口率NA 成反比，l 若把最大镜口率1.25（即油镜镜口率）代入公式，可以最小分辨距离/2由于可见光中最短波长（紫光）为0.4um（即400nm）。l 普通光镜最大分辨力的理论极限为0.2um ,请记住0.2um，这个数值就是显微镜水平与亚（超）微水平的分界线。l 显微镜的分辨力是有一定的极限，l 其放大率受分辨力制约而不可能无限提高，普通光镜放大率的经验界值：有效放大倍数极限=物镜镜口率1000。l 例普通显微镜的油镜镜口率为1.25,故此台显微镜的最大有效放大倍数为1250倍。l 高级研究显微镜油镜镜口率为1.4，则此镜的最大有效放大倍数为1400倍。l l 如果放大倍数

3、超过限度，则视野中物象变模糊，细微结构反倒分辨不清，成为了无效放大，由于物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能更大提高，所以科学家们从两个途径来改进显微镜：l、换用短波长的照明光源提高分辨力，如紫外光显微镜，电子显微镜；l应用特殊光学效应增强反差，提高分辨能力。2、相差显微镜（phase contrast microscope）l 用于没有染色的活细胞l 原理：光波的三个光学特性（1）光波有波长，对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化（2）光波有振幅，对于光波振幅变化（即振幅差）肉眼觉察为明暗变化（3）光波有相位（相位是指某一时刻光在其前进路线上的位置）对于光相位的变化（即相位差），肉

4、眼不能觉察。l 当光线穿过无色透明且非匀质的被检物体（例如活细胞）其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现了一定程度变化，此时观察感觉反差小，物体内部结构难分辨，这就是普通光镜不适宜用于观察活细胞的原因，相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而反差增强，使能够清晰看到被检物体及其内部细微结构，所以相差显微镜下的样品不需染色，可清晰观察活细胞及其内部结构的变化。l 特点：相差显微镜有正反差和负反差两种类型，正反差（暗反差）观察效果是被检物质比周围背景略暗，物体外围显现一

5、圈亮的光晕，而负反差（明反差）的效果则是相反。l3、荧光显微镜 （ fluorescence microscope）l 原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析，荧光现象有两种：（1）自发荧光细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所激发的荧光，例如叶绿素血红色自发荧光。（2）诱发荧光在细胞中加入某种不会使细胞化学组分变性的荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。l 例：荧光染料吖啶橙，可使RNA 发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。 特点：与普通光镜在结构上不同之处是：l（1）采用紫外光发生装置，高压灯+激

6、发装置+滤光装置。l（2）透镜由石英玻璃制成，以便减少道路上的紫外光损耗。l（3）目镜中装压紫滤片（保护眼睛）。l l 荧光显微镜目前在分子细胞生物学研究中应用十分广泛，以荧光素标记各种探针进行基因定位分析和对某些特异蛋白质进行定性定位检测分析，灵敏清晰，在荧光显微镜下对样品可同时采用两种以上（有的多达612种）荧光探针检测，依据其不同颜色的荧光信号，我们能一次判断识别多个基因位点，因此这是非常实用的研究技术，此外，由于在荧光标记检测实验中，易发生一些非检测目标出现假象的“背景噪音”问题，因而现可在荧光显微镜设备上安装一套“数字成像处理系统CCD”，即把图像信息通过摄像机和电脑的图象数字化处理

7、，使信号反差可以放大增强，对假象削弱or削除从而明显提高检测的精确率和灵敏度。 l4. 倒置显微镜：l 是将相差显微镜的构件颠倒装配，本末倒置而成的，并装有恒温设备，闭路电视和缩时摄像机，是完善的细胞培养和观察监视系统（光源在上，目镜在下）、（培养皿，瓶中活细胞生长生活情况）。l5.微分干涉显微镜:l 是另一种不需染色而直接观察活细胞中精细结构及动态变化的技术设备，其分辨力比普通光镜提高一个数量级。l6.激光共焦点显微镜:l 激光共焦点显微镜的物镜和聚光镜是聚集同一焦点能排除平面以外荧光干扰，所以其分辨率比普通荧光显微镜提高1.41.7倍，还可以“光学切片”方式观察较厚样品的内部结构。（二）电

8、子显微镜l1 、 透 射 电 镜 （ t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n microscope,TEM）l 透射电镜的放大原理与光镜基本类似，只不过是以电子枪所发射的高速电子流代替了照明光源，又以三组电磁线圈所构成的磁透镜代替了玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜。l 第一组磁透镜能将电子流聚焦到样品上（故称为会聚镜）；第二组磁透镜能使穿透过样品的电子射线折射形成初级放大像（称为物镜）；而第三组磁透镜则是通过第一第二中间镜和投影镜进行连续三次的再放大，最终投射到荧光屏上，使电子图象转变成了可见的光学图象。 图2-12 JEM-1011 透射电子显微镜图2-1

9、3 莱卡超薄切片机l特点：l（1）照明光源不同；l（2）放大倍数的调节方式不同，是依靠改变磁透镜的微磁电流强度来调节放大倍数的，也就是说，电流强度的变化引起了磁场强度的改变，而磁场强度的变化又使电子射线的折射程度发生改变，因而放大倍数即随之出现变化；l（3）有高压稳压系统，电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低。 通常透射电镜的电压达几万十几万伏的高压；l（4）有高度真空的工作系统。因为高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞就会改变它的发射方向，导致成像模糊，故要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水（真空中水易蒸发or升华，电子流与水分子相碰，改变

10、其方向，使成像模糊）因此说透镜电镜不能用来观察活的样品；l（5）样品厚度必须900（即90nm,0.09um）这是因为电子穿透能力有限，样品过厚则成像不清晰，并且高速穿透的电子会产生热量，将原样品烧出白斑，所以透镜电镜观察的样品须超薄切片（400500）不能用普通电镜下的组织切片（27um）；l（6）标本染色技术不同，电镜标本染色并不像光镜标本染色上各种颜色，而是使观察的结构与背景之间，黑白对比分明，反差强。所以电镜标本染色剂大多是重金属盐类。染色方法有正染、负染两类，正染常采用醋酸铀或柠檬酸铅染色，使得被观察的结构较暗，背景较亮；负染则是使用磷钨酸染色，使得背景较暗，而观察的结构显得明亮突出

11、； l（7）特殊的投影技术（真空喷镀法）是对电镜标本的表面处理技术，即以真空喷镀仪在真空条件下，将金、铂等金属微粒倾斜地喷向标本，使其朝向发射原的表面沉积的金属微粒多于背面，因而电镜观察时感觉反差极强，具立体感。 （8）冰冻蚀刻（或冰冻断裂）技术freeze etching or freeze-fracture 是研究细胞各种膜相结构的处理方法，先将样品放入-190低温下迅速冰冻，再在真空中用冷却刀切割断裂，随后上升温度，让冰在真空中升华成水汽跑掉，断裂面的细微结构暴露出来，再用真空喷镀仪在断面上喷一层碳膜或铂碳膜（称为“表面复型膜”）然后拿出真空之外，用有机溶剂将样品溶解掉，置“表面复型膜”

12、于铜网上，即可上电镜观察了，因此，电镜下看到的实际上已不是样品本身，而是样品某一断裂面的“人工复制品”，这是因为人为的这种表面变型膜能比生物样品本身有更强的电子反差性能，能够以富有立体感的浮雕形式精细地反映出某一断裂的细微结构。对于“冰冻蚀刻处理的生物膜各个面，国际上统一（规定命名称为PS”代表面向细胞质基质的表面）。l2、扫描电镜（scanning electron microscope SEM）：l 工作原则不同于透射电镜，是以电子束在样品表面扫描，用闪烁器收集样品表面散射回来的二次电子信号，再经放大，最后在荧光屏上显示图像。l 特点：不需要经过复杂处理，即可观察标本的原始外表面。l优点：

13、l（1）可观察较大，较厚的样品l（2）景深大（景深聚焦后能清晰看到物象的前后距离范围），所以图像是十分逼真的三维立体形象l（3）其放大倍数是从2020万倍的连续变倍，不须重复多次对焦，故对观察研究很方便l（4）样品可在样品室内做多方位的水平移动和转动，便于从各个角度来观察样品的全貌。l缺点：l（1）分辨力不太高，仅310nml（2）不能观察样品内部。（三）扫描隧道显微镜（scanning tunnelling microscope STM） 特殊显微镜，不是电镜，是新型探测样品外表的纳米级微观形貌的高级仪器，具有三维立体扫描物体表面的原子尺度高分辨能力，并能在常规大气or液体条件下观测样品，无

14、须强求真空环境，也不采用高能电子流攻击样品，故有利于观察样品的真实自然形态，这是目前开展纳米结构生物学研究的重要技术，已用于直接观察DNA分子，蛋白质分子及生物微精细结构。二、细胞生化分析（ 一 ） 组 织 化 学 和 细 胞 化 学 染 色 法（histochemical and cytochemical staining methods）l 利用某种显色剂能与某种细胞成分特异性结合，显示特定颜色的原理对组织和细胞内某些成分进行定位和定性分析的研究方法，可对无机盐蛋白质，醛基、碳水化合物、脂类、核酸和酶类等多种成分检测鉴定。l例：孚尔根反应（Feulgen）: 特定显示DNA的细胞化学技术，

15、其原理是经稀盐酸水解打开DNA上嘌呤碱与脱氧核糖之间的连接链，暴露出羟基，由于羟基还原作用与无色品红（希夫试剂）结合形成紫红色的化合物，据此可对细胞内的DNA进行定性和定位检测，此外，由于染色的深度与DNA浓度是成正比关系，所以当孚尔根法染色后，再用显微分光光度计测量，即可对细胞内的 DNA含量进行定量测定。l再例：l comori法显示酸性磷（pi）酸酶（溶酶体标志酶） （二）免疫细胞化学: （immunocytochemistry）依据抗体能与对应的抗原自行相互识别结合的免疫学原理来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况，首先将某种抗体联结上标记物（光镜观察用的标记物是荧光素or 酶，而电镜观察

16、用的标记物是胶体金），再与组织or 细胞样品混合反应，随后在光镜or 电镜下检查标记物沉积的部位，即对抗原进行定位测定，如果标记物是荧光素时，则是在荧光显微镜下检查荧光信号部位，以显示抗原存在位置。 抗体与抗原结合的方式分直接法和间接法两种:l(1)直接法是先将抗体与荧光素结合，然后将样品用荧光素标记的抗血清浸染，使荧光抗体与抗原结合反应后，再在荧光显微镜下鉴别抗原的存在部位。l(2)而间接法的不同之处是在抗原抗体初级的基础上，再增加一种能同初级抗体发生结合反应的次级抗体（即“抗抗体”），从而使初级反应得到“放大”，以增强分析观察的灵敏性和准确性。 如果与抗体联结的标记物是酶，则可采用与酶的底

17、物反应，产生呈某种颜色的沉积物，再依据这种特定颜色沉积物的出现位置，来对待测物质的定性定位分析，这被称为酶标抗体法（酶联反应），例如辣根过氧化物酶是常被用作标记物的酶，该酶可催化过氧化氢 H2O2同二氨基联苯胺发生氧化反应，形成棕色的沉积物，从而可在光镜或电镜下进行观察分析。l 当不存在抗原时，但随机出现了沉积（无论是否抗体与抗原结合，荧光素都会沉积，酶也与底物反应）故采用洗脱来避免此现象。（ 三 ） 显 微 分 光 光 度 测 定 技 术microspectrophotometry l 细胞内各种化学成分对光的吸收均有专一的波段，例如核酸是吸收紫外光260nm光波，氨基酸则吸收280nm光波

18、，此外，有些细胞成分经过细胞化学染色技术处理后，也可对可见光波有特定的吸收光谱，依据这种特性，运用显微分光光度计可对某些细胞成分进行定位和定量分析。目前，最先进的显微光谱分析仪器是流式细胞光度计。它是采用激光作为光谱测量光源，还采用了细胞流动系统和电脑数据处理系统，所以一秒钟可测定 5000个细胞的多种参数，如DNA 含量,蛋白质含量，细胞体积和直径等等。（四）显微放射自显影microradiographyl 依据照相原理利用放射性同位素所发射出来的射线（主要是 粒子）使感光材料（照相乳胶）上产生潜影（此过程称为“曝光，”即让照相乳胶上的AgBr还原成Ag），再经过显影和定影，即可观察到用同位

19、素标记的某种物质在标本中的位置和数量。l 常用的放射性同位素有3H、14C、32P和35S、等，用3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-T），可测定DNA的合成代谢，用3H标记的尿嘧啶核苷可研究RNA的合成代谢，用14C or 35S标记可研究蛋白质的合成，由于此技术灵敏度很高，是对生物大分子进行精细定位的有效方法。l其操作过程：l（1）同位素标记实验样品l（2）样品标本制备（包括固定、包理、切片 or 超薄切片 or 滴片）l（3）涂布乳胶（在暗室）l（4）曝光（自显影，在暗盒内）l（5）显影、定影、清洗l（6）染色l（7）光镜下或电镜下观察l 由于放射性同位素标记有对人不安全，且操作步骤复杂，费时

20、费工的缺点：因此目前在基因定性研究方面大多改用非放射性标记方式例如应用生物素标记或地高辛标记来替代同位素，在生物素或地高辛上联结荧光素或酶，再以荧光显微镜或酶联反应来检测，效果亦很好。l （放射性同位素对操作者不安全，废渣、废水处理对环境污染，只有在对实验要求灵敏度很高的实验中使用）。（五）超速离心技术ultracentrifugationl 是细胞生化分析研究的基础实验方法，是分离纯化细胞亚微结构和生物大分子的重要技术手段，超离心可达几万几十万转/分（g）的高转速，各种细胞亚微颗粒在离心场中的沉降速率不一样，衡量各种物质颗粒在单位强度离心场中沉降速率的量度，称为沉降系数。沉降系数的单位叫斯维

21、伯格单位Svedberg unit 简称“S”，各种细胞亚微结构和蛋白质颗粒都具有各自固定的S值。l1、差速离心differential centrifugationl 是利用不同离心速度所产生的离心力差别，可将大小不同的亚微结构颗粒分离开，此法适用于分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒，而对于差别较小的则应采用密度梯度离心法。l2、密度梯度离心density gradient centrifugation 首先将离心溶液制备成连续or不连续增高的密度梯度，其密度变化的范围与待分离颗粒的密度大致相当，然后通过一段时间离心操作后，不同密度的颗粒就会分别集中在相应的密度梯度区带之中，得以分离。 l常

22、用的密度梯度离心方法有两种：l（1）蔗糖密度梯度离心，即事先配制一系列不同浓度的蔗糖浓度，分先后顺序缓缓注入，离心管制成自下而上速减的浓度梯度（520%或1060%）再将待分离的颗粒混合悬液加在最上面，然后在离心过程中，这些颗粒在蔗糖浓度梯度中沉降，当沉降达到平衡状态时，不同类型的颗粒便会分别集中在不同浓度区带，最后掌握在颗粒区带到达管底前停止离心按区带分别收集样品（在管底开口）l（2）氯化铯密度梯度离心，氯化铯的密度梯度不需事先制备，而是在离心场中自行形成稳定的连续梯度，在离心前，将待分离的生物大分子悬液加入氯化铯溶液中，离心时氯化铯形成稳定梯度后各种生物大分子便会向梯度中相当的浮力密度的位

23、置移动，最终每种类型的大分子在等密点形成一条狭窄的带，因此这种方法又被称为等密度梯度离心。三、细胞生理测试（一）细胞膜电位测定:l 细胞膜内外两侧的阳离子浓度不同，通常是外高内低（外正内负），造成细胞膜内外具有一定的电位差，被称为膜电位，例如一般动物细胞的膜电位是6090mv，膜电位的变化能反映细胞生理变化，譬如当神经兴奋信号传导时，或肌肉收缩运动时，膜电位都发生显著变化。l 测量膜电位采用微电极，微电极是由毛细玻璃管构成，管内注满KCL溶液，插入一根银丝，Ag丝用导线与电位计or示波器连接。l 测量时使用一对微电极，一个插入细胞内，一个插在细胞外的介质中即可以电位计or示波器来显示和记录细胞

24、内外的电位变化。l（二）细胞电泳cell electropboresis l 细胞表面的分子具有电荷基团，因此在外加电场作用下，悬液中的细胞都会朝正极泳动这称为细胞电泳，不同类型的细胞 or 处于不同生理状态下的同种细胞，由于其细胞表面的电荷是有所不同，所以在同电场中的电泳对研究细胞癌变有重要作用，此外，细胞电泳装置还能用来分离不同种类的活细胞。l 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴， 在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，统计结果，并可根据

25、这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%（图2-24）。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。 四、其它实验技术（一）细胞培养 cell culturel 胚胎培养离体组织culture细胞 culture.l 细胞 culture是细胞生物学的基础研究技术，同时在医学、农业等领域都有广阔的应用价值。l 原理：将生物体的某一类群细胞，甚至单个细胞分离出来，放入具有适合细胞生活条件的培养器皿中，维持并促进其正常生长和繁殖。l技术环节：l 细胞分离，culture 条件和培养基，细胞分离方式机械分解，酶解处理，动物组织细胞通常以胰蛋白酶消化细胞内

26、的联结，植物组织细胞则多以纤维素酶和果胶酶消化细胞壁等联结物质，细胞培养条件要尽可能与生物体内生理状况一致。主要是培养温度，PH值和渗透压等，此外，细胞 culture还必须保持严格无菌，因为离体细胞已脱离了生物体免疫系统保护，是极易受bacteria . 真菌等微生物的污染侵害，培养基的选择是决定culture成败的技术关键，培养基主要成分包括：各种氨基酸，维生素，碳水化合物，无机盐以及能促进细胞生长，分裂的生长素，细胞激动素等，动物细胞 culture基中还需要增添胎牛血清。细胞培养方式： 液体悬浮培养，平板培养，回转玻璃管培养。细胞培养的名词概念：l（1）传代：当培养细胞 长满一层后，分

27、瓶接种再培养，每传一次称为一代（同时分裂生长接触一致）l（2）原代细胞：指从组织中分离出来，连续培养五代之内的细胞l（3）传代细胞：连续培养五代以后的细胞l（4）细胞株(cell strain): 从原代培养物中接种出来的一群不均一的细胞群（染色体数目不变，不能无限长期传代、繁衍）。 （5）细胞系：cell line是具有固定特性和标志的一个类型培养细胞。l 细胞系一般都是转化细胞，可以无限传代长期繁衍下去，每种细胞系都具有特殊的遗传标志特征，例如具有某种生化药剂的抗性突变基因，而且这些遗传标志在继续培养中可保持稳定不变这样才能被学术界公认为是一个新的细胞系，（接触不一致，染色数目突变）。l

28、l 细胞系是供细胞遗传学，细胞生理学、免疫病理学研究工作用的好试验材料，l 例如：Hela 细胞系是1953年取自一位美国黑人妇女子宫颈癌上皮细胞，现在全世界都采用该细胞系做人类细胞生化等研究研究的典型材料；再如世界著名的动物的细胞试验材料之一：CHO 细胞 line(Chinese hamster ootheea)取自中国仓鼠卵巢组织的细胞系。（6）克隆clone： 即无性繁殖系。 目前有植物clone, 动物clone,微生物clone, 胚胎clone, 细胞clone和分子clone之分，细胞clone即指由单个细胞培养繁殖而成的一群遗传性状完全相同的细胞群体，如果一个细胞系是通过clone形成法产生的，那么这个细胞系就可称为一个clone。l 单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler 和Milstein 1975 将两种细胞杂交，产生了能无限繁殖并能分泌抗体的杂交细胞而创立了单克隆抗体技术，获1984 年诺贝尔奖。脾细胞骨髓瘤（二）细胞显微操作技术micromanipulationl 运用结合操作可对细胞进行微量注射，细胞核移植