尼龙固定化木瓜蛋白酶

1、尼龙固定化木瓜蛋白酶一 实验原理通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、离子吸附）、包埋法、共价键结合法、交联法。固定化酶的优越性主要表现在：（1）在大多数情况下，可提高酶的稳定性；（2）提高酶的使用效率，降低生产成本；（3）酶不与产品混合，制品易于纯化；（4）利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键，经 HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO则与酶

2、中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）戊二醛（交联剂）酶，即尼龙固定化木瓜蛋白酶。二.实验材料、试剂及仪器3.1 材料尼龙布(86)或(66)，100目，剪成33cm2。3.2试剂1(1) 甲醇溶液(含18.6CaCL2和18.6水)（每组50mL）：称18.6克CaCL2 溶于18.6 mL蒸馏水，冷却后，用甲醇定容至100 mL。1(2) 3.5molL HCl溶液（每组30mL）：取29.2 mL浓HCl，定容至100 mL。1(3) 0.2 molL硼酸缓冲液(pH 8.4) （每组30mL）：称取0.858克Na2B4O710H2O和0.68克H3BO3用蒸馏水溶解，定容至100 mL。

3、1(4) 5戊二醛(以0.2mo1L pH 8.4硼酸缓冲液配制，每组30mL）：取25戊二醛20mL，用0.2mo1L pH 8.4硼酸缓冲液定容至100 mL。2(5) 0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液 （每组250mL）: 称取1.28克Na2HPO42H2O和1克NaH2PO412H2O用蒸馏水溶解，定容至100 mL。2(6) 0.5mo1L NaCl溶液用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制（每组150mL）: 称取2.93NaCl，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。3(7) 木瓜蛋白酶溶液(1mgmL，用0.1mo1/L pH 7

4、.2磷酸缓冲液配制 （每组15mL）：称取100 mg木瓜蛋白酶粉末，加1 mL激活剂，研磨10min,用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。3(8) 激活剂用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制，含半胱氨酸10mmo1L，EDTA 1mmo1/L（每组50mL）：称取0.12克半胱氨酸和0.04克EDTA，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。4(9) 0.5酪蛋白用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制（每组20mL）。称取0.5克酪蛋白，加100 mL0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液，37下保温振荡3h，至

5、酪蛋白溶解。4(10) 10三氯乙酸(用蒸馏水配制) （每组40mL）：称取10克三氯乙酸，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。3.3仪器恒温水浴锅, 紫外分光光度计, 冰箱。 四.实验步骤4.1固定化酶的制备(1) 每组取5块尼龙布洗净，凉干。用含18.6% CaC12和18.6%水的甲醇溶液在室温下保温10秒钟左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘，取出用水冲去污物，用吸水纸吸干。(2) 尼龙布用3.5mo1L HCl在室温水解45min，用水洗至pH中性。(3) 尼龙布用5戊二醛在室温下浸泡偶联20min。(4) 取出尼龙布，用0.1molL pH7.2磷酸缓冲液反复洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶

6、液(1mgmL)在4下固定3.5h(酶液用量每块布为0.8mL)。 (5) 从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5 mo1L的NaCl(用0.1molL pH7.2磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。4.2 酶活力测定（1）溶液酶活力测定 取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，37预热10min，加入37预热10min的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸2mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。以4000rpm转速离心5min或者过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。在上述条件下 ，

7、 在酶反应的10min内增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）（以下同）。 表1 酶活力测定试剂溶液酶固定化酶残留酶对照组12对照组12对照组12激活剂（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或块）0.20.20.21块1块1块0.20.20.237保温10min37 0.5%酪蛋白（mL）11111137反应10 min10% TCA （mL），摇匀2222222221%酪蛋白（mL）111离心或过滤取上清A280nm（2）残留酶活力测定 同溶液酶活力测定。（3）固定化酶活力测定 取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。五.数据处理及计算活力回收=（固定化酶总活力数/溶液酶总活力数） 100相对活力=固定化酶总活力数/(溶液酶总活力数残留酶活力数) 100六.注意事