肝功能损伤实验-副本

1、肝功能损伤实验目的n 通过小鼠肝损伤模型的建立及肝损伤后血中转氨酶测定，熟悉赖氏比色法测定ALT的基本原理和ALT标准曲线的绘制，熟悉肝损伤指标变化的机制，了解赖氏比色法测定ALT的影响因素及其评价。(一一)肝损伤动物模型建立肝损伤动物模型建立 【原理】n向小鼠腹腔注射CCl4，导致小鼠肝脏损伤，当肝细胞损伤后，细胞中转氨酶会外溢到血中，致血中相关酶活力显著增高。同时设一对照组(小鼠腹腔注射食用油)以作比较。试剂n 1豆油。n 22CCl4溶液 以豆油为溶剂配制(VV)。 操作步骤 1动物准备 取小鼠若干只，体重约1520g只，室温饲养，水、食物可自由摄取。n 2小鼠肝损伤模型的建立 腹腔注射

2、ccl4溶液02ml只，24h后取血。n 3对照小鼠模型的建立 腹腔注射豆油02ml只，24h后取血。n 4血样品采集方法 以镊子挤压小鼠眼眶近颞部，小鼠眼球即突出，用镊子夹住眼球向外摘出眼球，让血滴入小塑料离心管，收集血量约1ml左右，等血凝结后，离心取血清。注意事项n1摘除小鼠眼球采血，应让血滴自然滴入离心管，尽量不要将小鼠头在管口刮取，否则易致溶血。最好仅用一只眼球摘除放尽血，可减少血液损失。n 2离心时加速及减速不宜过快，离心速度为 3000r/min，10min 过快易致溶血。 (二二)肝损伤相关酶指标测定肝损伤相关酶指标测定1ALT测定(赖氏比色法)n【原理】L-丙氨酸+-酮戊二酸

3、 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 碱性条件下 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙(红棕色，=505nm)n a-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼生成相应的酮戊二酸一2，4-二硝基苯腙，但其在505nm等摩尔吸光度只有丙酮酸-2，4-二硝基苯腙的l3左右，根据此点可测出丙酮酸量。与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中ALT活性 。操作步骤n（1）ALT标准曲线绘制：n a. 按下表向各管加入相应试剂nb. 混匀，放置10min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“0”号管吸光度为该标准管的吸光度值。n c. 以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡

4、门活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。操作步骤n（2）标本的测定n 在测定前取适量的底物溶液及中毒组和对照组血清，37水浴预温5min后使用；具体操作按下表进行。n混匀，室温放置10min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。结果计算n 测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在标准曲线上查得ALT的卡门氏单位n 参考范围525卡门单位。注意事项n底物缓冲液中的一酮戊二酸和显色剂2，4硝基苯肼均为呈色物质，吸样必须很准确。n每批试剂的空白管吸光度波动范围应在0.24-0.32之间，如超出此范围，应检查试剂及仪器等方面问题。n严重脂

5、血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和2，4一二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。注意事项n赖氏法考虑到底物浓度不足，酶作用产生的丙酮酸的量不能与酶活性成正比，故没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门单位。赖氏法标准曲线所定的单位是用比色法的实验结果和卡门分光光度法实验结果作对比后求得的，以卡门单位报告结果，卡门法是早期的酶耦联速率测定法，卡门单位是分光光度单位。定义为血清1ml，反应液总体积3ml，反应温度25，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一

6、个卡门单位（相当于0.48IU），赖氏比色法测定由于受底物一酮戊二酸浓度的不足以及反应产物丙酮酸的反馈抑制等因素影响，标准曲线不能延长至200卡门单位。当血清标本酶活力超过150卡门单位时，应将血清用生理盐水稀释后重测。其结果乘以稀释倍数。注意事项n加入2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全，加入NaOH溶液的方法和速度要一致，如液体混合不完全或NaOH溶液的加入速度不同均会导致吸光度读数的差异，呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系，NaOH浓度越大呈色越深，NaOH溶液小于0.25mol/L时，吸光度下降变陡，因此NaOH浓度要准确。方法学评价方法学评价重复性差 其原因有三：由于-酮

7、戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼反应生成相应的-酮戊二酸苯腙因而限制其用量，如一般采用2.0mmolL的浓度，反应速度只有最大反应速度的65，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线形关系2，4一二硝基苯肼在碱性条件下也能显色，为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的2，4-二硝基苯肼(1.0mmolL)。此种水平的2，4-二硝基苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应。酶促反应中2，4-二硝基苯肼与这两种酮酸的结合显色度不易控制，低浓度的2，4-二硝基苯肼使标准曲线弯曲呈非线形也影响测定结果。方法学评价方法学评价产物旁路效应，即ALT催化生成的产物丙酮酸，被乳酸脱氢酶催化而消耗，从而影响测定结果。这种现象称为产物旁路效应。n(2)准确性差 由于线性范围只有97卡门单位(临床上绘制到150卡门单位)，但临床病人标本在200卡门单位以上较多见。尽管采用标本稀释后再测定，结果乘以稀释倍数，但偏差较大。影响实验条件的因素多，而且不易控制，系统误差大方法学评价方法学评价n(3)试剂稳定性差 底物缓冲液不易保存(易长菌)，易失效。故保存期短，影响试剂的批间结果的一致性。n(4)赖氏法是比色法中比较合理的方法。可以理解为