酪蛋白等电点实验讲解学习

1、酪蛋白等电点实验一、生物化学实验要求与实验室规则一、生物化学实验要求与实验室规则 1、遵守课堂纪律、维护课堂秩序，不迟到、不早退，严禁打闹，进入实验室必须穿实验服。 2、原则上不允许请假。如是病假，须医院开具证明，且要辅导员签字；如是事假，列出事假理由，并有辅导员签字。由于请假漏做的实验，需要补做，否则零分。无故旷课，则零分，且实验课须重修。 3、实验前要认真预习，掌握实验的目的、 原理，熟悉操作步骤。听从老师的安排，不违规操作，注意自身安全。实验完成后要及时书写实验报告（实验名称、日期、目的、原理、步骤、结果、结果分析、思考题，文字简练、准确、认真，实验报告下一次实验课开始前上交，统一用实验

2、报告纸）。 4、实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应及时复原。实验完成后，仪器洗净并放回原处，将实验产生的垃圾打扫干净，方可离开实验室。 5、注意节约药品、试剂；洗涤和使用仪器时要小心仔细，防止损伤仪器及造成自身伤害；发现仪器故障应立即报告老师，不可擅自动手检修。 6、严禁在实验室吸烟、喝水、吃东西。 7、每次实验课结束，由班长负责安排值日生，负责打扫实验室卫生。二、生物化学实验的基本操作二、生物化学实验的基本操作 （一）常用玻璃器皿的洗涤玻璃器皿洁净与否，是实验结果是否准确的重要环节。洁净依据：内壁应十分明亮光滑，无水珠附在玻壁上。1、新购玻璃器材的清洗：一般用12

3、%的稀盐酸浸泡12h，有条件的可以用浓硫酸浸泡30min，再用水冲洗，以去除附着的油污、灰尘和金属离子等。2、用过的玻璃器材清洗：（1）一般器皿（如烧杯、试管等） 用肥皂水和毛刷刷洗，再用清水冲洗干净。（2）定容分析器皿（如吸量管、量筒等） 比较干净的，直接去离子水冲洗即可；否则用铬酸（酸性和氧化性）洗液浸泡，自来水和蒸馏水冲洗。（3）粘附有血浆的刻度吸管清洗 45%尿素浸泡或1%氨水浸泡后，再稀盐酸浸泡，对于顽固污垢可再次采用重铬酸钾溶液浸泡。 （二）常用器材的使用方法1、吸量管种类和使用（1）种类：移液管、奥氏吸管和刻度吸管移液管移液管奥氏吸管奥氏吸管刻度吸管刻度吸管 （2）刻度吸管的使用

4、 使用前： 吸管无破损且干净；选取合适的量程；观察有无“吹”字：若有，说明刻度到尖端，放液后需将尖端的溶液吹出，否则不吹。 握法：拇指和中指夹拄吸管，食指游离。 取液：垂直入液 ，且入液深度适中； 吸耳球吸取液体，并使液高高于待量刻度2-3cm； 食指按紧吸管上端，并提离液面、观察液内有无气泡。 放液至刻度：刻度吸管垂直，右眼与刻度线平行，轻轻松开食指（转动刻度吸管），使液面缓慢降低，直至最低点与刻度线相切。 放液至容器：刻度吸管垂直，容器倾斜45，使溶液自然流入容器，注意吹与不吹。 注意：一根吸管只吸取一种试剂；严禁用嘴吸。 2、自动移液器的使用优点：使用方便，取、加样速度优点：使用方便，取

5、、加样速度快，计量准确，不易破损，可以快，计量准确，不易破损，可以吸取多种液体（只需要换枪嘴即吸取多种液体（只需要换枪嘴即可）可）移液器使用方法和注意事项移液器使用方法和注意事项 （1）设定移液体积：）设定移液体积： 从大量程调节至小量程为正常调节方法；从小量程调节至大量程时，应先调至超过设定体积刻度，再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度。 （2）装配移液枪头装配移液枪头 ：将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧即可。 （3）吸液及放液：）吸液及放液： 垂直吸液；吸头尖端浸入液面3mm以下，吸液前枪头先在液体中预润洗2-3次确保移液的精度和准 ； 慢吸慢放，以防突然松开溶液吸入过快而

6、冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气；放液时如果量很小则应吸头尖端可靠容器内壁。 （4）不适合吸取浓度和粘度大的液体）不适合吸取浓度和粘度大的液体（可采用反向移液技术移取高粘度液体） 。 （5）吸有液体的移液枪不应平放，）吸有液体的移液枪不应平放，枪头内的液体很容易污染枪内部而可能导致枪的弹簧生锈。 （6）移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，）移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，让弹簧回复原型以延长移液枪的使用寿命 （7）移液枪校正 ：可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL蒸馏水20时重0.9982g. （8）移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机

7、物等）。 （9）严禁使用移液器吹打混匀液体。 （10）不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度； 同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。 （11）如液体不小心进入活塞室应及时清除污染物；定期清洁移液枪外壁，可以用95%酒精或60%的异丙醇，再用蒸馏水擦拭，自然晾干。 3、溶液的混匀、过滤及离心 （1）混匀的目的：）混匀的目的：使反应体系内的各种物质分子很好的相互接触，充分的进行反应；使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。 （2）常用的混匀方式）常用的混匀方式 ：腕混匀、指弹混匀、吹吸混匀、搅拌混匀、磁搅拌混匀、涡旋器混匀等。 （3）混匀注意事项：）混匀注意事

8、项：防止液体溅出，严禁用手指堵塞容器口。 （4）过滤：）过滤：收集滤液、沉淀或洗涤沉淀。三、分光光度法三、分光光度法 （一）分光光度法的原理（掌握） （二）如何求被测组分的含量（掌握） （三）分光光度计的基本结构 （四）分光光度法计的使用与注意事项（一）分光光度法（一）分光光度法 概念概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点特点：灵敏度高（可达10-510-6mol/L）、精确度高（误差5%）、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分。（二）分光光度法的原理（二）分光光度法的原理 LambertLambert（朗勃）定律（朗勃）定

9、律I0I入射光强度透过光强度LC液层厚度液层厚度0IIT 透光率lkIIolg BeerBeer（比尔）定律（比尔）定律ckIIolgI0I入射光强度透过光强度LC液层厚度液层厚度 Lambert-Beer（朗勃-比尔）定律lkIIolgckIIolglckIIolgIIlgA表示，即A用），absorbance度，称作吸光度（表示溶液对光吸收的程IIlg由此可见，溶液不透光。乎被溶液完全吸收，即值无穷大，表示光线几IIlg时，0I当线较多；值大，表示溶液吸收光IIlg时，II当光线；，表示溶液完全不吸收0IIlg时，I I当公式的意义：0000000lckA（三）如何求被测组分的含量（三）如

10、何求被测组分的含量1、利用标准管计算测定物的含量、利用标准管计算测定物的含量2 2、利用标准曲线计算测定物含量、利用标准曲线计算测定物含量3 3、利用标准系数法求出待测溶液的浓度、利用标准系数法求出待测溶液的浓度4 4、利用消光系数法求出待测溶液的浓度、利用消光系数法求出待测溶液的浓度（1）利用标准管计算测定物的含量）利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（）标准液的吸光度（AS），），同时也测定末知浓度（同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（）的吸光度（AU），），CsAsAuCuCsCuAsAuAuAsLsLuKs：KuKsCsL

11、sAsKuCuLu：Au即比值之比值也等于两浓度之与所以因为根据定律得（2 2）利用标准曲线计算测定物含量）利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（们的吸光度。然后以各管吸光度（A A）为纵坐标，各管的）为纵坐标，各管的浓度（浓度（C C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即到一条通过原点的直线，即标准曲线标准曲线，亦称工作曲线。以，亦称工作曲

12、线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 标准曲线（浓度标准曲线（浓度-吸光度曲线）吸光度曲线）对末知浓度物质测对末知浓度物质测定时，无需再作标定时，无需再作标准管，据测定管吸准管，据测定管吸光度从标准曲线上光度从标准曲线上即可求得测定物的即可求得测定物的浓度。浓度。 0.20.80.40.6AC（四）分光光度计的基本结构（四）分光光度计的基本结构光源光源单单色色光器光器吸收池吸收池检测检测器器显显示示钨丝钨丝灯灯 可见光源可见光源3501000nm35

13、01000nm氢氢灯灯氘氘灯灯紫外光源紫外光源 200360nm200360nm棱镜棱镜衍射光衍射光栅栅玻璃比色杯玻璃比色杯石英比色杯石英比色杯硒硒光光电电池池光光电电管管光光电电倍增管倍增管玻璃玻璃能吸收能吸收UVUV光，仅适用于可见光，仅适用于可见光区。光区。石英石英不能吸收不能吸收紫外光，适用于紫紫外光，适用于紫外光区。外光区。将光信号转变为将光信号转变为电信号的装置。电信号的装置。记录装置：记录装置： 讯号处理和显讯号处理和显示系统。示系统。分光光度计使用的注意事项分光光度计使用的注意事项 比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不比色杯应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随

14、意挪用。得随意挪用。 比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。比色杯应持其侧壁的毛玻璃面。 盛液时达到盛液时达到比色杯的比色杯的3/43/4即可，不能太满，外壁如有液即可，不能太满，外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。 测毕，比色液测毕，比色液一般应倒回原试管一般应倒回原试管中，直至计算无误后中，直至计算无误后方可倒掉。方可倒掉。病原菌多基因调控机制研究病原菌多基因调控机制研究实验一实验一酪蛋白等电点测定酪蛋白等电点测定（P62）实验目的实验目的 通过实验进一步了解蛋白质的理化性质 理解等电点的意义及蛋白质在等电点时的性质 熟悉蛋白质等电点测定的操

15、作方法实验原理实验原理 蛋白质是两性电解质，分子中含有的氨基和羧基均可电离。当溶液中的pH值大于等电点时，其氨基电离被抑制而羧基电离，蛋白质成带负电荷的阴离子。反之，当溶液pH小于蛋白质等电点时，其羧基电离受到抑制而氨基接受质子，蛋白质成为带正电荷的阳离子。当溶液pH值达到某一值时，蛋白质分子成为所带的正、负电荷数相等的兼性离子，此时溶液的pH值就是该蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质的粘度和溶解度均大幅降低。 本实验观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解状态以测定其等电点。以醋酸和酪蛋白溶液中的醋酸钠构成各种不同pH值的缓冲液，在某种溶液中，酪蛋白溶解度最小时，该溶液的pH值就是酪蛋白的等电点。（三）实验材料 器材：200和1000L可调移液枪、试管、试管架、刻度吸管等 试剂：1.00mol/L、0.01mol/L和0.100mol/L