免疫组化考试必备

1、组织化学：在形态学基础上应用化学、物理和免疫学方法研究细胞、组织中物质的化学组成、分布和含量的一门学科；主要是通过以化学反应为主的染色方法在组织和细胞的原位上显示出各种物质的特殊性，并借助光镜和电镜观察组织和细胞的形态改变，探讨与功能、代谢变化的关系及其意义。组织化学技术的基本要求：1、保持组织细胞良好形态结构； 2、高度特异性；3、高度灵敏性；4、反应产物定位精确、具稳定性；5、与周围对比鲜明，易于识别；6、方法简便、化时少、重复性好。*常用的组织化学显色法：1、金属沉淀法-磷酸酶；2、偶氮偶联法-萘酚族化合物；3、Schiff氏反应-多糖（PAS反应）和DNA（Feulgen反应）；4、联

2、苯胺反应-过氧化物酶检测；5、普鲁士蓝反应-含铁血黄素；6、甲 反应-脱氢酶。金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检物质或酶的活性，如磷酸酶的显示法。对组织化学方法的评价：优点：能测组织中微量物质；取材小、反应较灵敏 缺点：测定步骤较多、试剂昂贵；影响因素多组织化学方法的应用：1、寻找病原微生物；2、帮助诊断和鉴别诊断；3、研究探讨发病机制；4、研究药物作用后的代谢改变等；5、为临床治疗提供治疗方案选择*石蜡切片的制备：标本取材组织固定固定后处理脱水透明浸蜡包埋切片粘片脱蜡各级酒精水洗染色封片。*细胞标本：印片法、穿刺涂片法、体液沉淀涂片法、活细胞培养标本。注意事项：

3、涂片用载玻片应先涂粘附剂，防止脱片；涂片时细胞应分布均匀、或用细胞离心涂片器。标本取材的注意事项：1、材料新鲜、固定及时 2、防止挤压 3、注意组织大小及厚度（宜小而薄） 4、正确选择取材切面及部位 5、保持清洁，去除坏死物、血污、粘液等物质 6、去除不需要的组织如周围脂肪组织等 7、防止组织干燥 8、标本编号、分瓶存放、低温保存固定：即标本取材后采用特定的试剂作用于细胞或组织，使其尽量保持生活时的形态和结构，该过程称为固定，该试剂即为固定剂。标本固定的目的：1、防止组织自溶和腐败 2、使组织某些成分凝固或沉淀、变成不溶性物质，避免弥散，保持原有生活时形态 3、使组织硬化，便于制片 4、有利于

4、染色反应标本固定的优缺点：优点：可保存形态结构；能长期保存； 缺点：物质损失；组织皱缩 ；影响常规染色；固定剂的特性和作用：1、具相当穿透力 2、具媒染效果 3、固定剂与蛋白质间发生化学反应，改变分子结构，产生沉淀 4、使蛋白质变性成沉淀状态 5、使蛋白质凝胶化、不溶于水。*甲醛类固定剂：优点：渗透力强、收缩小 ；保存脂类和类脂体 ；价廉 缺点; 福尔马林色素形成 ；PH酸性影响胞核着色 ；抗原决定簇被掩盖*Carnoy液：由无水酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml组成，混合后保存备用；可保存糖原、尼氏小体等；对显示DNA、RNA效果很好。优点：穿透力强，能快速固定，对胞核固定好，有固定

5、兼脱水作用；缺点：破坏红细胞。标本固定的注意事项：1、固定组织应尽量小，一般应小于2.0×1.5×0.5 cm；固定液一般为组织体积的510倍 2、固定应及时、适时 3、选择合适的固定剂 4、注意固定时的温度，不宜过高。*常用固定方法：1、浸泡固定 2、蒸汽固定 3、灌注固定 4、微波固定石蜡切片的优缺点及注意事项：优点：可使组织保存良好形态结构；能连续切片；能长期保存；缺点：影响组织的抗原性；注意事项：1、取材与固定 2、脱水、透明、浸蜡冰冻切片的优缺点及注意事项：优点：快速、简便；可保存抗原性和酶活性；缺点：易形成冰晶，影响抗原定位；需特定仪器设备；不能长期贮存；不宜作

6、常规病理切片检查及回顾性研究；注意事项：防止冰晶形成；防止组织块失水；加温速融。PAS染色(Periodic Acid Schiff's stain)原理：过碘酸是一种强氧化剂。组织或细胞内存在的糖原或多糖类物质中的乙二醇基（CHOH-CHOH）由于过碘酸的氧化，断裂为两个醛基（CHO），然后与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于组织或细胞内。经淀粉酶消化后PAS仍阳性，可见于糖原以外的糖类。结果：阳性物质成紫红色，颗粒或均质团块状，红色深浅反应含糖原多少，胞核呈绿色。应用：1、证明与鉴别细胞内空泡状变性 2、心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究 3、糖原沉

7、积病的诊断和研究 4、糖尿病的诊断和研究 5、用于某些肿瘤的诊断与鉴别奥蓝过碘酸Schiff 染色（AB-PAS染色法）原理：Alcian blue是一种碱性染料，其化学成份为水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，能与酸性糖类的酸根结合并显色。当pH=1时，仅能与硫酸根结合；当pH=2.5时，能同时与涎酸根和硫酸根结合。其与PAS反应结合，能区分酸性和中性粘多糖，首先所有酸性粘多糖被奥蓝染色，不再与PAS反应，仅中性粘多糖为PAS阳性。结果：中性黏液呈红色，酸性黏液呈蓝绿色应用：1、胃粘膜肠上皮化生的分类（不完全型肠化生和完全型肠化生）； 2、消化道腺上皮肿瘤的黏液分型（胃型和肠型）。 分类原理：胃

8、型黏液：中性粘多糖为主（PAS+）；肠型黏液：酸性粘多糖为主（pH2.5 时AB+）。注意事项：1、AB液pH值2.5；2、先作AB染色（因高碘酸氧化后形成的羧基可与AB非特异性结合产生假阳性）高铁双胺奥蓝染色（HID-AB染色法）原理：在pH1.5、三氯化铁为促染剂时，N.N二甲基-对苯二胺/ N.N二甲基-间苯二胺试剂中的二胺盐可与硫酸根聚合成棕黑色沉淀（高铁双胺法）。之后AB液（pH2.5）与涎酸羧基结合反应形成青蓝色。结果：硫酸黏液呈棕黑色，非硫酸黏液（包括涎酸黏液）呈青蓝色。应用：1、胃粘膜肠上皮化生的分型（小肠型肠化生和结肠型肠化生）；2、肠型消化道腺癌的诊断。 分型原理：小肠型黏

9、液：涎酸粘多糖为主（AB+/pH2.5）；结肠型黏液：硫酸粘多糖为主（HID+）。注意事项：1、AB液pH值2.5；2、HID液即用即配；3、先作HID染色（因AB结合硫酸根后阻碍HID反应）HID-AB-PAS染色：硫酸黏液棕黑色，涎酸黏液青蓝色，中性黏液紫红色。主要用于胃粘膜肠上皮化生的分型。核酸的染色方法：1、Feulgen法 2、甲基绿-派洛宁法Feulgen法：脱氧核糖核酸在盐酸的作用下，脱氧戊糖与碱基断开，戊糖端形成醛基（CHO-CHO）与无色Schiff试剂反应生成紫红色的复合物，从而把DNA显示出来。Feulgen法与PAS法比较：PAS法用过碘酸使六碳糖中的1,2乙二醇基（C

10、HOH-CHOH）变成二醛基（CHO），然后与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，在有多糖的部位，就会呈现紫红色阳性反应。Schiff试剂中的酸浓度对两个反应的效果不同，当pH为3.04.2时，对Feulgen反应染色好；而pH2.4时适宜于作PAS反应。甲基绿-派洛宁法：甲基绿派洛宁为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿能与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁能与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其染色的机制可能为电离和聚合作用。原位末端标记技术：运用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的荧光素dUTP缺口末端标记法（TUNEL法）检测D

11、NA裂解、细胞凋亡。即以TdT酶和核苷酸混合形成标记一抗，以羊Fab片断偶联抗荧光素抗体和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记形成二抗，再用底物显色。*核仁组成区(NORs)：由核糖体基因rDNA盘聚在人类近端着丝点染色体短臂次缢痕区域，因在一定条件下可用银染方法定位，并证实其结构，所以称为NOR嗜银蛋白(AgNOR)。它与核糖体的形成及细胞内蛋白质的合成关系密切，可用来反映核仁结构和功能改变。*AgNOR染色结果：AgNOR颗粒为深棕色。*AgNOR形态分型：单一型、弥散型、聚集型、核仁内型、混合型。良性病变单一型较多；良性病变中一般不见单独的核仁内型与聚集型；恶性肿瘤弥散型发生率高；混合型在良恶

12、性病变中无差别。酶的组织化学：是用组织化学的方法证明酶的存在，即利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并用显色反应使反应产物具有可见性，从而在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其部位。酶组织化学的基本原理：细胞内的酶催化分解合适的底物，使生成中间产物，即初级反应产物，此为第一反应，即酶促反应，然后初级反应产物与辅助物（或称捕捉剂）经一步或两步反应，生成有色不榕性的终反应产物，此为第二反应，称捕捉反应。该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在。酶组织化学的基本条件：1、必须在保存良好的形态结构的同时尽量保存酶 2、必须保存良好的定位，使反应产物沉积在原位 3、保证反应产物的特异性。酶组织化学的

13、一般原则：1、组织或细胞的预处理和切片的制作过程应不影响待检酶的活性及分布 2、底物和其它辅助物必须同时迅速穿透组织和细胞中 3、所选底物只能被一种酶所催化分解 4、所选的辅助物不影响细胞膜内酶的活性和其它反应试剂的穿透性 5、酶底物反应的产物能迅速与辅助剂起反应，形成的终反应产物为不溶于水的有色而稳定的物质，能长时间保存 6、所有参与反应的试剂除与被检测酶发生反应外，均不能与组织或细胞其它成分结合或吸附。*反应产物弥散的影响因素：1、底物在酶催化下水解的速度 2、初级反应产物在缓冲液中的弥散系数 3、初级反应产物与辅助物的反应速度酶组织化学的主要步骤：1、酶的固定 2、酶的特异性反应 3、在

14、最适条件下酶反应产物的沉着 4、使沉着物具有可见性证明酶特异性的对照实验：1、用酶活性抑制剂 2、采用无底物的孵育液 3、用过固定或加热的方法使酶失活 4、用针对目标酶的激活剂 5、改变孵育液的底物 6、选择最适PH 7、酶细胞内的定位差异酶组织化学的显示方法：1、金属离子沉淀法-如酸性磷酸酶的硫化铅法 2、偶氮偶联法-如萘酚AS化合物 3、联苯胺色素法-如过氧化物酶 4、四唑盐法-如脱氢酶 5、靛蓝反应-如吲哚酚酯（BCIP）磷酸酶的显示方法：金属沉淀法（ALP的钙钴法，ACP的磷酸铅法）、偶氮偶联法。钙钴法和偶氮偶联法比较：钙钴法：有非特异性染色，易出现假阳性；反应产物易扩散，定位欠佳；需

15、设置对照组。 偶氮偶联法：保温时间短，方法较灵敏；因正常组织中无萘酚，故不需设置对照；反应产物为偶氮燃料，较磷酸钙更难溶解，图像清晰，并且可以控制反应深度。免疫组织化学：是应用免疫学和组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究的技术，主要是利用抗原与抗体之间具有高度特异性结合的特性，先从组织或细胞中提取某种化学物质作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去检测组织或细胞中存在的相应抗原，之后借助组织化学的方法显示出抗原抗体的结合部位并进行半定量测定。免疫组织化学的特点：1、高度特异性 2、高度敏感性 3、应用广泛性 4、方法快速性 5、定位

16、精确性免疫组织化学技术按照标记物种类可以分为：1、荧光素-荧光免疫技术 2、酶-免疫酶技术 3、高电子密度标记物-免疫电镜技术 4、胶体金-免疫胶体金技术 5、具双多价结合力亲和物-亲和免疫组化 6、同位素-放射自显影技术免疫组化的全过程包括：1、抗原提取和纯化 2、免疫动物（抗体制备）或细胞融合（单克隆抗体制备） 3、抗体效价检测和提取 4、标记抗体 5、细胞和组织切片标本制备 6、免疫组化反应和显色 7、观察和结果记录抗原：是指一切能刺激机体产生相应抗体和/或致敏淋巴细胞，并能和这些抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗原具有两方面的特性：一是能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，称为免疫

17、原性；另一种是能与相对应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，称为反应原性。抗原决定簇（表位）：是抗原分子表面具化学活性基团的区域，不同种属间的同一抗原物质，具完全或部分相同的抗原决定簇。多克隆抗体（Polyclone antibody，pcAb)：即由抗原免疫动物产生的抗体，因抗原有多个抗原决定簇，由多个B细胞克隆同时受刺激产生的抗体。单克隆抗体（monoclone antibody，McAb)：是针对抗原分子上一种抗原决定簇的一个B 淋巴细胞克隆分泌的抗体。它是应用细胞融合杂交瘤技术制备的。免疫组织化学染色过程中的基本技术：1、组织标本的取材和固定 2、玻片的处理 3、抗原修复 4、抗体稀释

18、法 5、免疫组织化学染色方法抗原修复：是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂、微波、金属盐等方法对被掩盖的抗原决定簇或变性抗原进行暴露或修复，使抗原得到一定程度的恢复过程。抗原修复的方法：1、酶消化法 2、微波辐射法 3、酸水解法 4、高压加热法 5、去垢剂处理法石蜡切片中抗原降低的主要原因：1、甲醛固定液中醛基与抗原蛋白中的氨基交联，封闭了抗原决定簇 2、甲醛使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，形成网络结构而掩盖抗原决定簇 3、组织从脱水、透明、浸蜡、烘片过程，温度过高及其他理化因子使抗原性破坏、丢失*微波辐射法的原理：1、热效应：辐射场内极性分子运动加速，使被封闭抗原决定簇重新暴露或修复

19、2、化学反应：化学物质与部分决定簇结合起化学反应，增加通透性，抗原抗体结合更多 3、微波直接作用：高频电磁波作用，使打开蛋白质之间的交联，使抗原决定簇中化学链获得修复抗原修复方法的评价：酶消化法：使部分抗原决定簇暴露，染色性增强同时破坏部分抗原；对某些膜抗原、激素受体、癌基因及部分淋巴细胞抗原无增强作用甚至有破坏作用，使结构受损，增加弥散，不利定位观察； 微波修复法：广泛应用，不同型号微波功率不同，价格贵； 酸水解法：能增强特异性染色，降低背景着色，但水解过度对抗原有破坏； 高压加热法：对部分抗原经高压加热，染色强度和效果比微波好；时间不易掌握，会发生非特异性抗原暴露，增加背景染色； 单纯加热

20、、高压加热、微波等方法：温度在95 以上，必须使用修复缓冲液；单纯加热法对封闭牢固的抗原决定簇暴露不太理想。抗体稀释法的目的：寻找抗体最佳工作浓度最佳稀释度，即能得到最强的特异性染色、最弱的背景染色时的抗体稀释度。影响抗体稀释度的因素：1、抗体的浓度、质量、有效期 2、抗体中非特异性蛋白质的含量 3、孵育时间长短 4、染色方法灵敏度差异*免疫组化染色的注意事项：1、抗体保存、配制 2、显示剂合理使用 3、对照设计 4、结果判断等免疫荧光组织化学技术的基本原理：是根据抗原抗体反应的原理，将已知的抗体与荧光素结合，以此标记的抗体与细胞或组织中的抗原结合，形成抗原抗体复合物，通过荧光显微镜激发光的照

21、射，可使结合在抗原抗体复合物上的荧光素散发出荧光，从而可以对组织或细胞中的抗原进行检测。免疫荧光组织化学技术的特点：特异性强、敏感性高、速度快。荧光：是指一个分子或原子吸收并储存给予的能量后进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以荧光形式释放出来。荧光素：即一类天然人工合成的有机化合物，在紫外光或短波照射下可发射荧光，这种能产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。自发荧光：是指组织（细胞）内少数成分未经荧光素染色，经短波照射便可发出荧光。继发荧光：是指用能发光的色素（荧光素）染液或标记物标记的细胞成分所呈现的荧光。荧光效率：是指吸收光能转变为荧光的百分数，即发射荧光的光量子数（荧

22、光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）X 100%。荧光的淬灭：是指荧光物质的荧光辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。荧光寿命：是指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。用于标记的荧光素必须具备的条件：1、与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解 2、未结合的色素与降解产物易排除 3、被标记后的结合物，不影响抗体效价，不影响荧光强度 4、荧光色素所发荧光与组织内自发荧光易于区别 5、制备方法简便、快速 6、安全、无毒、性能稳定、能长期保存、价廉免疫荧光染色方法的缺点：1、需特殊的荧光显微镜 2、荧光素易淬灭，标记切片不能保存过久，因而不

23、能反复检测 3、荧光染色常需新鲜组织，冷冻切片，故不能进行回顾性研究 4、组织内常有自发荧光出现，干扰标记切片的观察免疫荧光染色的注意事项：1、标本：以新鲜未固定组织为好，切片要薄 2、固定液：中性福尔马林固定时间<24h，温度要低 3、包埋：温度绝不能>60，使用低熔点石蜡（52） 4、脱蜡：脱蜡充分，玻片要清洁 5、染色：防抗体干，漂洗彻底 6、封固：缓冲甘油溶液或聚乙烯醇缓冲甘油混合液 7、荧光标本应避光、加盖，检查时间每次以1-2h为宜，集中检查 8、保存冰箱，短期（数天）荧光素的种类：异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）以及四乙基罗达明（RB20

24、0）。亲和细胞化学：利用两种物质间的高度亲和特性及其可标记性，将酶等标记物连接到亲和物上，以对体内待检物进行检测的方法。*亲和物质：是指一些具有双价或多价结合能力的物质，不但亲和物质之间有高度亲和力，而且可与各种标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等结合，从而在细胞或亚细胞水平进行另一亲和物质的定位、定量。*亲和免疫组织化学的优点：1、提高免疫组织化学定位的专一性 2、加强免疫组织化学染色的灵敏度，减少非特异性反应常用的亲和物质：1、生物素(Biotin)与卵白素(Avidin) 2、葡萄球菌A蛋白(SPA)与免疫球蛋白IgG 3、植物凝集素(Lectin)与糖结合物常用亲和物质的作用原

25、理：生物素与亲和素：生物素和亲和素分子具有高度亲和力，生物素能通过单一的生化反应结合大分子成分；亲和素可以和不同的标记物结合，亲和素也可作为桥，同时连接不同的生物素化的分子如抗体、酶等。葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白：SPA内含4个高度相似的Fc段结合区，即A、B、C、D区，能与多种哺乳动物血清中的IgG Fc段结合而产生沉淀，并能与多种标记物相结合，SPA 具有双价结合能力。ABC法(Avidin-Biotin-peroxidase complex method)：是指将卵白素和生物素偶联的过氧化物酶或碱性磷酸酶按一定比例组成卵白素-生物素酶复合物(ABC复合物)，卵白素作为桥梁，与生物素标记抗

26、体和生物素酶复合物连接，从而形成一种较大类似晶格的复合体，大大提高了免疫酶染色的灵敏度。标记卵白素-生物素法 (Labeled avidin-biotin, LAB法)：是以标记的卵白素连接生物素化大分子的反应体系，先用活化生物素偶联抗体，用酶标记卵白素，制备成生物素化抗体和酶标卵白素。桥式卵白素-生物素法 (Bridged avidin biotin, BRAB法)：是指利用卵白素作为桥梁，联结生物素偶联物质和生物素化的酶的方法，即用生物素分别标记抗体和酶，利用卵白素作为桥梁，将酶连接到特异性抗体 卵白素-生物素系统的评价：敏感性高、特异性强、方法简便、具有多功能性、应用范围广。内源性生物素

27、消除方法：根据一个生物素分子只有一个位点能与卵白素结合的原理，在ABC染色前，先以0.01%的卵白素处理标本20分钟，再用0.01%的生物素作用20分钟。卵白素与内源性生物素已结合，从而阻断了内源性生物素的活性，再加入生物素与前面的卵白素结合封闭其所有的结合点，由于组织中所有的生物素已和卵白素结合，因此不能再与ABC中的卵白素发生反应。免疫胶体金技术：以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研究。胶体金：又称金溶胶，是一种物质以1 - 100 nm大小的粒子分散在另一物质中所形成的体系。胶体金制备的原理：采用化学还

28、原法，即在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。影响溶胶稳定性的因素：电解质、胶体金浓度、温度、大分子物质。制备胶体金的注意事项：1、玻璃器皿的清洁：玻璃器皿清洗清洁液浸泡24h 流水冲蒸馏水反复洗涤晾干 2、试剂的配制：应尽量使用分析纯试剂，各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制 3、影响胶体金颗粒大小的因素：加入还原剂的速度、搅拌是否均匀、制备胶体金所用的烧瓶大小、加温至100°C时间超过15min或保存时间太长。胶体金标记前的准备工作：包括胶体金探针的制备以及胶体金蛋白质最佳结合率的测定。在标记之前需

29、将胶体金的PH值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱处，待标记的蛋白质也需要透析除盐及离心去除蛋白质聚合物等沉淀。免疫胶体金染色方法的基本原理：免疫金染色法（IGS法）：1、 直接法-将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色,然后在光镜或电镜下观察 2、 间接法-先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后加金标二抗或SPA与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究。 免疫金银染色法（IGSS法）：经免疫反应沉积在抗原位点处的胶体金颗粒作为一种催化剂，在对苯二酚存在的情况下，将显影液中的银离子催化还原成银原子，可将抗原位点清楚显示出来。免疫胶体金染色方法的特点：1、胶体金制备简便 2、标记简单

30、 3、特异性强 4、敏感性高 5、定位准确 6. 适应性广 7、易于双重和多重标记。聚沉：是指胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象。免疫组化染色对照的设计：目的在于排除假阳性或假阴性，正确评价免疫组化染色结果。包括阴性对照、阳性对照及自身对照，其中阴性对照又分为空白对照、替代对照、抑制试验、吸收试验。阴性对照：是指用确知不存在相应靶抗原的组织标本染色，结果应为阴性。包括空白对照、替代对照、抑制试验、吸收试验等。阳性对照：是指用已经证实含有靶抗原的组织切片与待检标本同样染色，结果应为阳性。自身对照：是指用同一组织切片或涂片上与靶抗原无关的其他结构做对照。空白对照：用磷酸缓冲液(P

31、BS)替代第一抗体（特异性抗体），其出现假阳性原因有：自发荧光、色素及内源性酶的干扰；第二抗体或桥抗体的吸附导致假阳性。替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替代第一抗体，染色结果应为阴性。抑制试验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再与标记的特异性抗体染色，结果明显减弱或转阴性。吸收试验：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，染色结果应为阴性。免疫组化染色对照设计注意点：1、每次试验同时做阳性对照和阴性对照 2、阴性对照应同时做空白对照和替代对照 3、间接法第一抗体阴性对照结果阳性时，应考虑第二抗体或桥抗体

32、的替代对照。特异性染色：是指抗体只与相应的靶抗原决定簇反应，并在含靶抗原的部位显示特异性阳性染色，凡不属于特异性反应的染色，均为非特异性染色或背景染色。导致非特异性染色的因素：1、靶组织或细胞（自发荧光、内源性酶、生物素和色素） 2、标记物 3、抗体 4、靶组织与抗体的相互作用*特异性荧光：是指由抗原抗体反应形成的免疫复合物所带荧光素在荧光显微镜下呈现的特异性荧光。非特异性荧光：是指特异性荧光以外的细胞或组织内的某些物质，在荧光显微镜下呈现各种颜色的荧光。*自发荧光：是指组织不经荧光素染色，在紫外光或短光波照射下所呈现的荧光，多为蓝绿色或蓝白色。非特异性荧光的消除方法：1、衬染法：将背景的细胞

33、和组织染成红色，与黄绿色的荧光形成鲜明对比 2、荧光抗体：去除游离或聚合的荧光素及未标记的蛋白质 3、胰蛋白酶消化4、吸收：用组织干粉处理荧光抗体 5、染色前用正常血清处理切片 6、采用双重标记的方法 7、提高抗体和标记荧光抗体的质量标记物导致的非特异性染色的消除方法：1、使用高特异性、高效价抗体和优质荧光素和酶 2、制备标准化的荧光或酶标抗体 3、染色前用SephadexG-25除去游离荧光素 4、用DEAE纤维素柱除去未标记的蛋白或过度标记的抗体 5、胰蛋白酶消化、正常血清处理或用肝粉吸收抗体引起非特异性染色的原因（及消除方法）：1、抗体蛋白的非特异性吸附-（高速离心去除凝集的抗体蛋白；0

34、.1%BSA或HAS（人白蛋白）封闭切片） 2、特异性抗血清不纯-（将抗原与抗体结合的沉淀线切下、捣碎后免疫动物；用不含靶抗原的组织匀浆或干粉置于37 1小时吸收抗血清离心取上清；使用McAb） 3、IgG 的交叉反应-（稀释羊抗兔抗血清，但不低于染色效价；改用不起交叉反应的血清；用5的人血清作为第二抗体的稀释液，起吸收作用） 4、共同抗原决定簇-（使用McAb；尽可能稀释一抗，采用敏感的免疫组化方法） 5、单一决定簇抗体的异质性 6、特异性抗原弥散 7、IgG 受体干扰-（采用敏感方法（ABC)， 高度稀释抗体；用福尔马林固定以破坏FC 受体） 8、其它：抗体浓度过高、不适当的反应温度、反应

35、时间过长、试剂变干燥、切片过厚-（加一抗前加正常血清或用含0.1%BSA 的稀释液稀释抗体；染色前蛋白酶消化，使组织内由于固定和包埋而隐蔽的抗原暴露，提高免疫反应性；增加一抗稀释度，以出现强阳性细胞和背景着色最弱时为最佳稀释度）免疫组化出现假阳性的原因：1、内源性酶、生物素和色素显色 2、抗体与多种抗原有交叉反应（抗原决定簇、IgG受体干扰、IgG交叉反应、抗体不纯等） 3、抗体与组织中某些成分非特异性结合 4、抗体浓度过高 5、孵育时间过长、温度过高和显色时间过长 6、抗原弥散 7、操作过程中冲洗不充分、脱蜡不彻底 8、切片折叠、干燥、脱蜡和粘片剂过厚等。免疫组化出现假阴性原因：1、抗体：失

36、活、浓度过低、 抗体与试剂盒不配 2、标本固定或修复方式不当（抗原丢失或遮蔽) 3、方法敏感度低 4、组织处理及实验操作步骤不当 5、冲洗后切片残留过多缓冲液 6、染色顺序、孵育温度时间、底物显色不当怎样判断特异性染色结果（即特异性染色的表现，而非特异性染色不存在这些表现）：1、阳性产物明显、细颗粒状，背景清晰对比鲜明 2、阳性染色强度深浅不一、阴性细胞和阳性细胞交叉存在 3、阳性产物定位明确胞内（膜、浆、核）、胞外 4、阳性细胞的分布状态：定性、定量等。原位杂交：核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，

37、RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。变性(denaturation)：是指双螺旋DNA分子在某些因素作用下，双链间的氢键解开或断裂， 解离成二条单链的过程。复性(renaturation)：又称退火，是指变性的两条DNA单链在合适的条件下，又可按原来碱基互补配对，再结合在一起形成双螺旋结构的过程。杂交(hybridization)：是指不同来源但具有同源性的两条DNA或RNA单链，按碱基配对原则结合在一起，形成稳定的异质性双链分子。探针(probe)：即一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段。靶核酸

38、分子：即所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA。原位杂交的基本原理：利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因或mRNA分子。原位杂交的优点：1、既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性 2、既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究 3、所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本 4、应用范围广探针的种类：1、根据标记物的不同，可分为放射性探针和非放射性探针 2、根据核酸分子不同可分为cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针 *cDNA探针的制备方法

39、：1、用生物工程技术获取特异的cDNA片段：从mRNA逆转录生成cDNA构建cDNA 文库筛选和克隆特异cDNA 分子 2、特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组 3、质粒转化 4、质粒扩增 5、质粒抽提、酶切、纯化得到特异的cDNA探针cDNA探针的优点：1、cDNA探针不含内含子序列，特别适用于基因表达的研究 2、DNA探针一般较RNA探针敏感 3、克隆于质粒载体中，使用方便，不需再次克隆 4、能用多种标记方法，可靠易行 5、杂交适宜温度范围较宽，较稳定，不易降解cDNA探针的缺点：1、要用凝胶电泳移除载体序列 2、探针需变性 3、杂交反应中可能存在自身复性RNA探针的优点：1、

40、模板反复多次转录，一次合成和标记量高 2、单链分子，在组织内通透性好，杂交效率比DNA探针高 3、RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定 4、通过改变外源性DNA的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可转录出正义RNA链和反义RNA链 5、杂交体所需解链温度高，能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤 6、标记后用不含RNA酶的DNA酶去除模板DNA，不需再纯化 7、杂交后用RNA酶去除非特异性吸附的RNA探针RNA探针的缺点：1、容易受RNA酶污染 2、制备过程复杂 3、杂交适宜的温度范围较窄寡核苷酸探针的优点：1、探针一般较小（1050bp），在组织内通透性好 2、为单链DNA寡

41、核苷酸，杂交时无需变性，无自身杂交 3、一次合成，可使用多时，价格低廉 4、对RNA酶不敏感，比RNA探针更稳定，便于操作寡核苷酸探针的缺点：1、与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定 2、探针较短，所携带的标记物较少，特异性、敏感性都低 3、标记方法受限制，只能采用末端标记法探针的标记方法及原理：1、双链cDNA探针的标记：随机引物法 2、RNA探针标记：在体外转录技术中与探针制备同时完成 3、寡核苷酸探针标记：主要是末端标记法*理想的标记物应具备的条件：1、标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同 2、标记后探针的检测方法要简便、准确、可靠、重复性好 3、安全无害*目前常用标记

42、物有同位素（35S、32P、33P 和3H）和非同位素（生物素、地高辛）两大类。组织样品制备时的注意事项：1、去除或抑制RNA酶：包括物理和化学方法 2、取材及固定：要求组织新鲜，取材过程中防止RNA酶的污染；为避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整性，可采用4%多聚甲醛等灌流或浸泡固定 3、包埋和切片：操作过程中要防止RNA酶污染，要求戴手套操作、切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用 4、玻片的处理：玻片上涂上粘附剂，防脱处理后高温消毒原位杂交中可能会出现哪些问题，应怎样避免这些问题：原位杂交实验失败：1、探针：主要考虑探针的敏感性、探针的浓度、探针长度及保存的好坏等 2、组

43、织材料的保存 3、实验过程中防止RNA酶的污染，做到严格的无RNA酶操作 4、杂交前处理：包括蛋白酶消化的浓度、时间等 5、杂交的条件：时间、温度等 6、杂交体的检测 脱片：1、玻片进行防脱处理 2、注意杂交前预处理时蛋白酶的浓度和消化时间 3、防止杂交后漂洗过度 非特异性染色：1、探针的特异性不高 2、组织细胞内内源性酶染色：可用0.5%5%H2O2和1mmol/L左旋咪唑分别处理以避免组织内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶的干扰 3、注意杂交后的漂洗：要用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC1X SSC0.5X SSC 37。原位杂交的特性以及与免疫组化的比较：、特性：1、时间短：与免疫组化操作时间相近 2、技术简单：杂交前预处理（蛋白酶消化等）杂交反应（滴加杂交液、变性、孵育杂交）杂交后处理（洗涤封闭、免疫组化信号放大等） 3、保持组织的形态结构：为细胞原位标记，不破坏组织的形态结构 4、可用于回顾性研究 5、可用于福尔马林固定的组织 6、避免同位素的使用：可使用生物素或地高辛标记 、比较：1、敏感性：原位杂交较免疫组化有极高的敏感性 2、特异性：免疫