生姜中蛋白酶的提取、分子量和含量的测定

1、课题一、生姜蛋白酶的提取与分离纯化课题一、生姜蛋白酶的提取与分离纯化课题二、生姜蛋白酶活力的测定课题二、生姜蛋白酶活力的测定课题三、生姜蛋白酶含量的测定课题三、生姜蛋白酶含量的测定课题四、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定蛋白酶分子量课题四、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定蛋白酶分子量材料：生姜材料：生姜试剂：试剂：0.01%0.01%考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250溶液、标准蛋白质溶液、溶液、标准蛋白质溶液、0.5%0.5%酪蛋白酪蛋白溶液、溶液、0.2mol/L pH7.50.2mol/L pH7.5的磷酸缓冲液、的磷酸缓冲液、0.05mol/L pH6.00.05mol/L pH6.0的磷酸盐

2、的磷酸盐缓冲液、缓冲液、1N HCl1N HCl、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶丙胶贮液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶丙胶贮液、浓缩胶丙胶贮液、过硫酸铵溶液、核黄素溶液、电极缓冲液、浓缩胶丙胶贮液、过硫酸铵溶液、核黄素溶液、电极缓冲液、40%40%蔗糖、蔗糖、pH4.7pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%0.5%溴酚蓝溴酚蓝仪器：研钵、透析袋、垂直板电泳装置、分光光度计、离心机、恒仪器：研钵、透析袋、垂直板电泳装置、分光光度计、离心机、恒温水浴锅、匀浆机、分析天平、稳流稳压电泳仪温水浴锅、匀浆机、分析天平、稳流稳压电泳仪生姜属姜科姜属植物，是一种重要的药

3、生姜属姜科姜属植物，是一种重要的药食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同源的保健品。目前，在食品中开发利用源的保健品。目前，在食品中开发利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待开发利用蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待开发利用的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁凝乳、蛋白质水解等方面。开发生姜蛋凝乳、蛋白质水解等方面。开发生姜蛋白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶资源长期依赖木瓜、菠萝等少数热带水资源长期依赖木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状。果资源的

4、现状。 从溶液中分离纯化可溶性蛋白质的主流方法包括：从溶液中分离纯化可溶性蛋白质的主流方法包括：等电点沉淀法等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零( (即正负电即正负电荷相等荷相等) )，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物

5、，从而有利于悬浮液的过滤。物，从而有利于悬浮液的过滤。盐析：盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。透析透析：是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的是通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。一种分离纯化技术。 生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取方法如丙酮、盐析沉淀法、硫酸铵沉生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取方法如丙酮、盐析沉淀法、硫酸铵沉淀法。淀法。本研究中采用磷酸盐缓冲液（本研究中采用磷酸盐缓冲液（Ph6.

6、0Ph6.0）提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析）提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析，可获得高酶活的，可获得高酶活的生姜蛋白酶，而且操作简单，成本低，易于产业化。生姜蛋白酶，而且操作简单，成本低，易于产业化。实验过程实验过程（1 1）生姜蛋白酶提取液的制备）生姜蛋白酶提取液的制备取外形完好无损伤，富含纤维的生姜取外形完好无损伤，富含纤维的生姜50g50g，切成小块，切成小块，按料液比按料液比1:21:2加入磷酸缓冲液，研磨匀浆加入磷酸缓冲液，研磨匀浆30min30min，所得，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液洗涤后，浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液洗涤后，收集滤液收集滤液44静置静置2

7、h2h，离心去沉淀，上清液用磷酸缓冲，离心去沉淀，上清液用磷酸缓冲液定容至液定容至100mL100mL，44冰箱贮存待用。冰箱贮存待用。（2 2）生姜蛋白酶的纯化）生姜蛋白酶的纯化 丙酮沉淀丙酮沉淀盐析盐析透析透析 丙酮沉淀丙酮沉淀：取生姜蛋白酶溶液：取生姜蛋白酶溶液20mL20mL，加入，加入1.51.5倍的倍的44预冷丙酮进行沉淀，预冷丙酮进行沉淀，沉淀完全后，沉淀完全后，44静置静置2h2h，冷冻离心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。，冷冻离心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。 盐析盐析：沉淀用磷酸缓冲液溶解，用四层纱布过滤，滤液再离心：沉淀用磷酸缓冲液溶解，用四层纱布过滤，滤液再离心30m

8、in,30min,取取上清液缓慢加入上清液缓慢加入1.21.2倍的冷丙酮酸轻轻搅拌倍的冷丙酮酸轻轻搅拌5min5min，离心，取沉淀溶于，离心，取沉淀溶于Ph6.0Ph6.0的缓冲液中，缓慢加入硫酸铵至的缓冲液中，缓慢加入硫酸铵至40%40%饱和度，低温静置饱和度，低温静置24h24h，离心，上清液，离心，上清液中继续加入硫酸铵至中继续加入硫酸铵至60%60%饱和度，低温静置饱和度，低温静置24h24h，离心取沉淀。，离心取沉淀。 透析透析：沉淀溶于：沉淀溶于0.010.01mol/L pH6.0mol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液中，采用截留分子量的磷酸盐缓冲液中，采用截留分子量14000U

9、14000U的透析袋进行的透析袋进行44透析，直至透析，直至1%1%氯化钡检查无白色沉淀为止。浓缩干氯化钡检查无白色沉淀为止。浓缩干燥得粗酶粉。燥得粗酶粉。生姜蛋白酶活力的定义：在一定温度（生姜蛋白酶活力的定义：在一定温度（4040）下，每分钟分解）下，每分钟分解酪蛋白产生酪蛋白产生1 1g酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。实验方法：实验方法：1.0ml1.0ml蛋白酶液与蛋白酶液与1.0ml0.5%1.0ml0.5%酪蛋白混合，酪蛋白混合，4040水浴水浴保温保温10min10min，加入，加入2.0ml0.4mol/l2.0ml0.4mol/l三氯乙酸

10、终止反应，静置三氯乙酸终止反应，静置10min10min后过滤。取后过滤。取0.5ml0.5ml滤液与滤液与5.0ml5.0ml考马斯亮蓝充分混匀，静置考马斯亮蓝充分混匀，静置5min5min，在在595nm595nm处，以对照调消光度处，以对照调消光度0 0，测量样品吸光度。，测量样品吸光度。蛋白酶活力的计算：蛋白酶活力的计算：蛋白酶活力单位【蛋白酶活力单位【U U】= OD595nm = OD595nm * * K K * * N NK-100K-100除以络氨酸标准曲线上除以络氨酸标准曲线上100mg/ml100mg/ml对应的对应的OD595nmOD595nm值值N-N-酶液稀释倍数酶

11、液稀释倍数实验过程实验过程（1 1）制作标准曲线）制作标准曲线取取7 7支支试管，依次分别加入试管，依次分别加入0.00.0、0.100.10、0.150.15、0.200.20、0.300.30、0.400.40、0.50mL0.50mL的牛的牛血清蛋白溶液，用水补足到血清蛋白溶液，用水补足到0.5mL0.5mL，每管再加，每管再加5mL5mL染色液，立即摇匀，置于室温染色液，立即摇匀，置于室温下下5min5min，然后测定在波长，然后测定在波长595nm595nm下的吸光度，并绘制标准曲线。下的吸光度，并绘制标准曲线。（2 2）生姜蛋白酶含量的测定生姜蛋白酶含量的测定吸取吸取0.5ml0.

12、5ml样品提取液于试管中，加入样品提取液于试管中，加入5ml5ml考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250染色液，充分混匀，染色液，充分混匀，静置静置5min5min，测量吸光度（，测量吸光度（OD595nmOD595nm），记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度），记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度 X X（g/ml)g/ml)（3 3）生姜蛋白酶含量计算）生姜蛋白酶含量计算生姜蛋白酶含量（生姜蛋白酶含量（g/mlg/ml）= =X X* *提取液的总体积提取液的总体积/ /样品鲜重（样品鲜重（g)g)实验过程实验过程1 1、试剂的配置、试剂的配置30%30%分离胶贮液；分离胶贮液；10%10%浓缩

13、胶贮液；分离胶缓冲液浓缩胶贮液；分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液；电泳缓冲液；浓缩胶缓冲液；电泳缓冲液；20%20%过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液1%TEMED1%TEMED；0.2mol/L,pH7.20.2mol/L,pH7.2磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mol/L HCl1mol/L HCl；10%SDS10%SDS；样品溶解液样品溶解液染色液；染色液；脱色液脱色液2 2、分离胶的制备、分离胶的制备（1 1）安装电泳槽）安装电泳槽（2 2）凝胶的制备（先配置分离胶，再配置浓缩胶）凝胶的制备（先配置分离胶，再配置浓缩胶）（3 3）灌胶）灌胶（4 4）样品处理）样品处理 待测蛋白质样品处理：获得的蛋白质样品待测

14、蛋白质样品处理：获得的蛋白质样品5050l,l,再加入再加入2x2x样品缓冲液样品缓冲液5050l l混匀，在混匀，在100100水浴中煮沸水浴中煮沸5min5min。（5 5）加样）加样待样品冷却后，用微量进样器吸取待样品冷却后，用微量进样器吸取30-40l30-40l样品，按号依次加入样品槽，使样品，按号依次加入样品槽，使样品沉降在凝胶面上。样品沉降在凝胶面上。（6 6）电泳）电泳（7 7）剥胶）剥胶（8 8）染色以及脱色）染色以及脱色 取下电泳后的凝胶板，放入染色液中染色取下电泳后的凝胶板，放入染色液中染色1h1h，倒回染色液，加入脱色，倒回染色液，加入脱色液，脱液液，脱液4-8h4-8h，其间更换脱色液，其间更换脱色液3-43-4次。将凝胶浸于水中或固定在次。将凝胶浸于水中或固定在20%20%甘油中甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。3 3