荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用 - 科学网

1、荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用导导 师：张玉奎师：张玉奎 学学 生：张生：张 琳琳中科院大连化学物理研究所中科院大连化学物理研究所1810组组 引言引言 常用荧光衍生化试剂应用简介常用荧光衍生化试剂应用简介 展望展望 衍生的目的衍生的目的 衍生发应方式衍生发应方式 荧光衍生试剂的构成荧光衍生试剂的构成 在线在线 (on line) 离线离线 (off line) 从衍生反应的场所来分从衍生反应的场所来分 柱前衍生化柱前衍生化 (pre-column derivatization) 柱上衍生化柱上衍生化 (on-column derivatiza

2、tion) 柱后衍生化柱后衍生化 (post-column derivatization) 从是否与仪器联机的角度来分从是否与仪器联机的角度来分 从是否形成共价键来从是否形成共价键来分分 标记标记 非标记非标记 取代基荧光团（试剂分子母体）反应基团胆磺酰肼 DNS-H 芳香邻二醛类 OPA 异硫氰酸酯类 FITC 酰氯类 FMOC 活性卤类 NBD-Cl N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类 AQC 邻苯二甲醛邻苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并恶二唑苯并恶二唑 NBD-Cl荧光素异硫氰酸酯荧光素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯氨

3、喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC J Chromatorgr. 1990,499:557高等学校化学学报高等学校化学学报 2004, 25: 189190J Chromatorgr. 1990,499:557Anal. Biochem 2003,313 1727图3 CEOC 衍生胺类化合物色谱分离图（23种）图2 FMOC 衍生胺类化合物色谱分离图（23种） 羰基氯类： FMOC CEOC 磺酰氯类: DNs-Cl 卤代三嗪类: EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）分析化学分析化学 2003, 31, 62651.苯酚 2.对氯苯酚 3. 2,5-二甲基苯酚 4. 2,4-二氯

4、苯酚 5. 1,4对苯二酚 肼类肼类 DNsDNs-H CEOC-H-H CEOC-H 氨基类氨基类 氨基甲基芘氨基甲基芘 1.乳糖 2.甘露糖 3.葡萄糖 4.鼠李糖 5. 山梨糖(FL detection)咔唑咔唑-9-9-乙氧基羰基肼乙氧基羰基肼(CEOC-H)(CEOC-H)柱前衍生中性糖高效液相色谱分离柱前衍生中性糖高效液相色谱分离IV IV 羧酸类化合物的衍生试剂羧酸类化合物的衍生试剂 溴甲基类 BrMMC 哌嗪基类 DBD-Pz 重氮甲烷基类 ADAM 其它类 9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽

5、重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)荧光衍生试剂与羧酸的反应荧光衍生试剂与羧酸的反应4-4-氨甲基氨甲基-6,7-6,7-二甲基香豆素二甲基香豆素 (ADMC) (ADMC) 衍生羧酸衍生羧酸 色谱分离图色谱分离图Anal.Sci.1996,12:189Fig.1 胆汁酸分离色谱图（荧光检测）. 衍生物的激发和发射波长分别为 ex=404, em=440nm9-(2-9-(2-羟乙基羟乙基)-)-吖啶酮吖啶酮 HEA HEA 衍生胆汁酸衍生胆汁酸 色谱分离图色谱分离图V V 分离对映体的手性荧光衍生试剂分离对映体的手性荧光衍生试剂Toshimasa Toyooka Japan

6、J.C.A 1998 822 215224 手性荧光衍生试剂手性荧光衍生试剂 R(-)DBD-PyNCS R(-)DBD-PyNCS 衍生分离衍生分离DLDL氨基酸氨基酸OPA OPA 与手性硫醇与手性硫醇 衍生分离衍生分离DLDL氨基酸氨基酸N-异丁酰基-D(L)-半胱氨酸 (IBDC和IBLC)J.C.A 1999 832 123目前目前常用常用衍生蛋白质的荧光标记试剂有：衍生蛋白质的荧光标记试剂有： 邻邻苯二甲醛苯二甲醛 ( (OPA) OPA) 4- 4-氟氟-7-7-硝基苯并恶二唑硝基苯并恶二唑 ( (NBD-F)NBD-F) 荧光素异硫氰酸酯荧光素异硫氰酸酯 ( (FITC)FIT

7、C) 3- 3-呋喃甲酰喹啉呋喃甲酰喹啉-2-2-羰醛羰醛 ( (FQ)FQ) Fig.5 OPA 柱后标记马心肌红蛋白质毛细管电泳图J.Am.Chem.Soc. 1995,117:3325 J.Am.Chem.Soc. 1989,111: 5008DNA序列分析中所用的四种荧光衍生试剂Nature 1986,327: 674Nature 1986,327: 674分析化学中的有机试剂在分析化学中占有与分析仪器同等重分析化学中的有机试剂在分析化学中占有与分析仪器同等重要的地位，荧光衍生化试剂则是有机分析试剂的一类重要分要的地位，荧光衍生化试剂则是有机分析试剂的一类重要分支。支。 性能优良的荧光衍生化试剂可能性能优良的荧光衍生化试剂可能将将成为成为某些某些物质的高灵敏物质的高灵敏高选择性分析的关键高选择性分析的关键，荧光衍生试剂的开发与应用荧光衍生试剂的开发与应用也也正正朝这朝这个个方向发展。方向发展。在实际工作中将可能遇到各种现有荧光衍生试