第六章离心技术

1、第六章 离心技术Chapter 6 Centrifugation第一节 原理与应用Section 1 Principles and applications一、离心技术的诞生、发展以及应用 离心技术（centrifuge technique）: 利用物质在离心力的作用下，按其沉降系数的不同而进行分离的一种技术。 诞生： 1872年，Misher使用离心机分离蜂蜜和牛奶； 发展： 1、1924年，瑞典的化学家Svedberg和Rinde制造了世界上第一台具有光学系统的超速离心机45000rpm； 2、1926年，Svedberg用其制造的离心机测定马血红蛋白的相对分子质量为68000； 3、19

2、40年， Svedberg和Pederson撰写了世界上第一本有关离心技术的专著； 4、1955年，Anderson发明了区带转头并证明了DNA的半保留复制的假说； 5、20世纪90年代，出现碳素转头；一、基本原理及用途 、绕中心轴作圆周运动时，受到离心力的作用； 、强大的离心力作用于悬浮的粒子，使其沿离心力背离中心轴； 、不同大小的颗粒沉降速度不同而有效的分离；1、颗粒在离心场中的沉降 、相对离心力（RCF） 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = ma = m2 ra 离心场加速度， m 沉降粒子的有效质量，粒子旋转的角速度，

3、r 粒子的旋转半径( cm )； 通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF （Relative Centrifugal Force）”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数； 单位是重力加速度“g”（980cm/sec2）。 此时“RCF”相对离心力可用下式计算： RCF = 1.119105(rpm)2 r (n: rpm revolutions per minute每分钟转数，r/min )RCF=F离心力F重力=m2rmg=(2n/60)2980r 由上式可见，

4、只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替： rav=( r minrmax) / 2r的测量如下图所示： 340rmin rmaxrav 科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCF av），即离心管中点的离心力。 为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole 和Cotzias 利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便。 换算时，先在r标尺上取已知

5、的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于rpm标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值，转数值处于rpm标尺左边，则应读取RCF标尺左边的数值。 左对左右对右、沉降系数（sedimentation coefficient，s ） 1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 若用2n/60表示，则：S=2.303Log(r2/r1)2 (t2-t1)积分得：S=dr/dt2 r=12dtdrr 式中r1为离心前粒子离旋转轴的距离；r2为离心后粒子离旋转轴

6、的距离，n离心机转速。S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。 S=2.1102Log(r2/r1)n2 (t2-t1) 如蛋白质，沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。校正溶剂为水，温度20时的沉降系数S20w可按下式计算： 式中r为沉降界面至转轴中心的距离，为转子角速度， 2 r为向心加速度，dr/dt为沉降速度。分子愈大，沉降系数愈高，故可根据沉降系数来分离和检定蛋白质。 S20W=dr/dt2 r 、沉降系数为生物大分子物质的特征常数，它与颗粒的密度、大小、形状、介质的密度和黏度有关； 、规定温度为20，以水为

7、介质的条件下，测得的S值为标准状态的沉降系数，非标态的沉降系数则应加以校正；蛋白质的沉降系数一般为1-200S之间； 、分析型超速离心机测定沉降系数，再通过S和Mr之间的转换求出分之质量；Mr=RTS20,wD20,W(1-V)R-气体常数，等于1.987卡/度.摩尔；S20，W-标准状态下粒子的沉降系数；D20，W-理想状态时粒子的扩散系数；V-微分比容，等于溶质粒子密度的倒数；-溶剂密度； T-热力学温度；、沉降速度（sedimentation velocity） 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。 式中r为球形粒子半径；为流体介质的粘度；P为粒子的密度；m为介质的

8、密度。 dxdt=2r2(p-m)2x9 从上式可知，粒子的沉降速度与粒子半径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为： S=dx/dt2 r=d218(p-m) 从该式中可看出：当Pm，则S0，粒子顺着离心方向沉降。当Pm，则S0，粒子到达某一位置后达到 平衡。当Pm，则S0，粒子逆着离心方向上浮。 、沉降时间（sedimentation time，Ts） 如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。 根据沉降系数（S）式可得：t2-t1=ln(X2/X1)S2 式中X2为离心转轴中心至离心

9、管底内壁的距离；X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离。、K系数（k factor） K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K系数愈小的，愈容易，也愈快将粒子沉降。 K=2.531011 ln (rmax/rmin)(rpm)2 其中Rmax为转子最大半径；Rmin为转子最小半径。 由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K系数是一个变数。 通常，离心机的转子说明书中提供的K系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。 如果已知粒子的沉降系数为80S的Polysom

10、e，采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管底所需的离心时间是Tk/S4h，利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。2、应用： 、这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物； 、测定生物大分子的分子量； 、大分子纯度的评价； 、检测大分子构象的变化；第二节 离心机的结构及主要的部件、性能Section 2 Configuration, Primary Parts and Performance一、离心机的结构 1、驱动系统 A、油轮驱动系统 高压枪喷油作动力，高达75000rpm； B、空气涡轮

11、驱动系统 C、磁悬浮驱动系统 D、电动驱动系统 2、制冷系统3、真空系统4、光学系统5、控制系统6、润滑系统7、防护系统 A、转动器减震装置，自动平衡，甲钢外套； B、自动限速、自动限温、自动锁定，运转时不易打开；二、转头及其类型1、角式转头（fixed angle rotor） 离心管腔与转轴成一定倾角的转头。孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在2040度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。 特点：具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的

12、对流扰乱，影响分离效果。 2、荡平式转头 （swinging bucket rotor） 由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成，最适合做密度梯度区带离心 ； 优点：是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，因而利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。 缺点：是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 3、 区带转头 （zonal rotor） 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持

13、样品带和梯度介质的稳定。 优点： 因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率；缺点： 样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。4、垂直转头（vertical tube rotor） 样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。 5、连续流动转头 （continuous flow rotor） 用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心

14、力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。 三、离心机转头的性能及主要参数 （一）转头的性能 材料：一方面坚固耐用，另一方面质量轻容易提速； 1、铝合金转头 特点： A、铝为两性金属，适用于近中性溶液离心，洗涤也考虑酸碱度； B、强度不高，但易加工； C、高浓度盐影响转头强度； D、高温使强度降低，不能灭菌； E、价格便宜，使用寿命短；2、不锈钢转头 特点： A、耐腐蚀； B、强度高，加工难； C、质量大，离心速度不高； D、寿命长，价格便宜；3、钛合金转头 特点： A、耐腐蚀； B、强度高，加工难； C、质量不很大，离心速度高； D、寿命长，价格较贵；4、碳素转头 特点： A、质量

15、轻，利于提速； B、耐腐蚀； C、机械强度高，加工容易； D、使用寿命长，价格昂贵；（二）转头的主要参数 1、最大转速 过速保护装置 2、最大离心力 3、最大容量 容量越大，转头越大，转速越低；四、离心管的性能及选择 （一）玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。 （二）塑料 1、PE（聚乙烯）管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。 2、PP（聚丙烯）管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。 3、PC（聚碳酸酯）管：透明度好，硬度大，能耐高温消毒。但不耐强酸强碱及某些有机溶剂。用于5万(转/分)以上离心。 4、CN（硝酸纤维素）管：质地较软，透明，但不耐强酸强碱及某些有机溶剂，不能高压消毒

16、。适合于蔗糖、甘油等密度梯度离心。应透明，利于收集。 （三）不锈钢 避免接触强腐蚀化学试剂；注意事项： 1、对称平衡 ； 2、防离心管内液体外溢。 失去平衡 污染转头和离心腔 影响感应器正常工作 3、超速离心一定要加满离心管，需抽真空，避免离心管变形。 4、杜绝使用变形老化离心管；台式高、超速离心机0.6-10万转/分以上离心机制备性分析性分析性超速离心机普通离心机冰冻离心机台式（或地面式）普通离心机0.3-0.6万大容量冰冻离心机小于0.6万转/分高速冰冻离心机0.6-2.5万超速冰冻离心机2.5-8万或更高五、离心机的种类及特点（一）按离心速度分类 1、低速离心机 低于6000rpm； 2

17、、高速离心机 低于25000rpm； 3、超速离心机 低于100000rpm；（二）按离心机的用途分 1、普通离心机 简单、低转速 2、制备型大容量低速离心机 3、高速冷冻离心机 4、超速离心机 5、分析型超速离心机 研究大分子的沉降特征和结构； 6、连续流动离心机第三节 常用的离心技术Section 3 Usual Centrifugation一、差速离心法 （differential velocity centrifugation ） 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。 操作过程

18、中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份二、区带离心法 （ zonal centrifugation ） 将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 优点： 分离效果好，可一次获得较纯颗粒； 适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒

19、； 颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长； 需要制备惰性梯度介质溶液； 操作严格，不易掌握。（1）差速区带离心法 不同颗粒间存在沉降速度差异（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。 原理原理 差速区带离心法差速区带离心法是离心前在离心管内先装入密度梯度介质是离心前在离心管内先装入密度梯度介质( (如如蔗糖、甘油、蔗糖、甘油、KBrKBr、CsClCsCl等等) )，待分离的样品铺在梯度液的，待分离的样品铺在梯度液的顶

20、部顶部、离心管离心管底部底部或梯度层或梯度层中间中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大，但最大轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒于的最小密度。这种方法是根据分离介质密度必须小于样品中粒于的最小密度。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中的粒子其在梯度液中沉降速度沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。的。 沉降系数越大，往下沉降

21、越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束；此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间。 该离心法的离心时间要严格控制，即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任意一个粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。 注意： 、离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大 ； 、最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm ； 、梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着

22、支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合； 、此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况； 、常用的梯度液有Ficoll、蔗糖、甘油、KBr、CsCl等 （2）等密度离心法 isopycnic centrifugation 又称等比重离心法，依粒子密度差进行分离，等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 原理原理 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，

23、此种密度等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在待分离的样品铺在梯度液面或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力梯度液面或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密

24、度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时速度为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子时速度为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 mP时粒子上浮；Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即Pm； 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，

25、其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。收集区带的方法： （1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。 （2）用针刺穿离心管底部滴出。 （3）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。（4）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。以超高速离心大量制备质粒

26、（3）梯度溶液的制备 A、梯度材料的特点 与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。 可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。 不会对离心设备发生腐蚀作用。 容易纯化，价格便宜或容易回收。 浓度便于测定，如具有折光率。 对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。 B、常用的梯度材料 糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。 无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。 有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺等。 硅溶胶：如Percoll。 蛋白质：如牛血清白蛋白。

27、 重水。 非水溶性有机物：如氟代碳等。C、梯度材料的应用范围 、蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 、聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 、氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有

28、较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 、卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 、Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯烷酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。 D、密度梯度的制备 、不连续密度梯度的制备 手工制作：先配不同密度的溶液，按从大到小依次加入到离心管，可借助注射器； 、连续密度梯度的制备 梯度混合仪： 线性密度梯度 指数连续密度梯度Isopycnic Equilibration(CsCl 梯度形成)Zone Centrifugation(預制梯度)高 速 离 心Gravity Centrifugation(无梯度) 高速离心与两种超高速离心法的比较：樣本：多为蛋白质密度相似、分子量不同者樣本：多为核酸密度不同、分子量相似者一般的重力离心仅把顆粒与