实验4_DNA片段的分离和回收,质粒DNA的连接和转化-Li

1、实验五实验五 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 质粒DNA的连接和转化第一部分第一部分 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNA片段的分离和回收片段的分离和回收硅基质材料法分离回收琼脂糖凝 胶中DNA片段实验目的：实验目的： 掌握利用硅基质材料法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术; 了解其他几种方法的原理与操作技术。DNA片段分离回收常用方法：片段分离回收常用方法： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法 玻璃奶法 硅胶膜离心吸附柱法电洗脱法电洗脱法 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相

2、。 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。 低熔点琼脂糖凝胶法低熔点琼脂糖凝胶法 将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。 待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的EP管中，加300 L TE。 65水浴10 min或更长使胶块完全融化。 酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。DEAEDEAE滤膜插片法滤膜插片法 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 取出膜片冲洗后转移到离心管

3、中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。硅胶膜离心吸附柱法硅胶膜离心吸附柱法实验原理：实验原理： 硅胶膜离心吸附柱：在高盐、低PH值的条件下通过电荷作用结合DNA，在低盐、高PH值时释放DNA。 硅基质材料和独特的缓冲液系统可以高效、专一结合DNA的，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质，回收100 bp-30 kb DNA片段。DNA 结合率影响因素：结合率影响因素： 盐浓度：盐浓度： DNA100bp:低盐状态下结合率高。 pH值：值： p

4、H7.0:结合率高。应应 用：用： 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； DNA浓缩，去盐及去除杂质。本方法的优点：本方法的优点： 高纯度高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等； 简便快速：简便快速：所需主要仪器是一架台式离心机；操作过程快速方便，几十分钟即可完成。 高效高效：独特的离心柱和精心配制的缓冲液，保证最大量回收到高纯度的目的DNA回收效率达到70%以上； 多样：

5、多样：可以回收单链、双链DNA片段以及环状质粒DNA 多用途多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等； 安全安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。实验材料：实验材料： 使用TianGen通用型DNA纯化回收试剂盒（ Universal DNA Purification Kit） 平衡液BL（Buffer BL） 30 ml 溶胶液PC（Buffer PC） 25 ml 漂洗液PW（Buffer PW） 15 ml 洗脱缓冲液EB（Buffer EB） 15 ml 无水乙醇方法和步骤：方法和步骤：琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段切取所要的DNA条带溶解琼脂糖/EB凝胶上

6、柱，DNA结合硅胶模离心洗脱DNADNA产量和质量测定方法和步骤方法和步骤1琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。2. 紫外灯下切取目的DNA条带。3将切下胶块放入干净的1.5ml EP管中，称重，以确定胶条的体积。若凝胶重为0.1g，其体积可视为100 l，则加入100l PC溶液。4. 向胶块中加入等倍体积溶液PC，50水浴放置10min，不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如有未溶胶块，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。方法和步骤方法和步骤5. 柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 l平衡液BL，12,000 rpm (13,400g )

7、离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。）6. 将上述第4步所得溶液加入平衡后的吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (13,400g )离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。方法和步骤方法和步骤7. 向吸附柱CB2中加入600 l漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。8. 重复操作步骤7。9.

8、 将吸附柱CB2放回收集管中，12,000 rpm 离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，防止残留漂洗液影响下一步实验。 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。方法和步骤方法和步骤10. 将吸附柱CB2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000 rpm 离心2 min收集DNA溶液。注意：洗脱体积不应小于30 l，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效

9、率；且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。11. DNA产量和质量测定：适当稀释DNA，测定A260及A280。按照计算公式计算DNA浓度：DNA浓度=吸光度260 x50 x稀释倍数mg/mlDNA纯度=A260/A280, 1.8表明样品核酸纯度90%。方法和步骤方法和步骤注意事项：注意事项： DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波紫外灯，切胶时间尽

10、量短，以免对DNA造成损伤。 使用前检查平衡液BL是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 对于300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 吸附柱容积为800 l，若样品体积大于800 l可分批加入。第二部分第二部分 质粒质粒DNADNA的连的连接和转化接和转化实验目的实验目的了解重组DNA分子连接及转化大肠杆菌的原理与基本操作方法。一、一、DNADNA分子的体外连接分子的体外连接实验原理实验原理 DNA分子的体外连接：在一定条件下，由DNA

11、连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸基团与3端羟基，使二者之间形成磷酸二酯键的生物化学过程。DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。DNADNA连接酶连接酶 常用的DNA连接酶: 来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4 DNA连接酶 DNA连接酶作用机理（T4 DNA连接酶为例）： T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-ATP复合物。 酶-ATP复合物结合到具有5-磷酸基和3-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。T7 DNA ligaseT4 DNA ligase注意事项注意事项 连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应

12、温度为37，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定。不同公司生产的DNA连接酶的最佳连接温度不同，对粘性末端与平末端的连接温度也不同。 连接效率：粘性末端效率高，平末端效率低，因而在底物浓度、酶浓度选择上存在差异。提高连接效率的方法：提高连接效率的方法： 提高DNA的浓度，增加重组子比例。 缺点：会出现DNA自身连接问题，对于单酶切和平末端的DNA片段尤其如此。 解决方法：对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口在转化细胞后得以修复。提高连接效率的方法：提高连接效率的方法： 将连接液放置4过夜可以增加连接效果。 连接反应结果检测： 转化宿主菌，阳性克

13、隆筛选。 DNA凝胶电泳。实验材料：实验材料： 纯化后的酶切质粒载体 目的基因片段 DNA Ligation Mix（Takara） T4 DNA 连接酶 缓冲液系统方法和步骤方法和步骤 反应体系： 线性化载体 pCDNA3 （EcoR I 和Xba I 酶切） 3 l（0.1 g）3倍分子的目的基因p38片段 （EcoR I 和Xba I 酶切） 5 lDNA Ligation Mix 8 总体积 16 l盖上管盖，混匀，台式离心机上离心秒。24连接1-3小时。反应结束后于-20保存。 二、重组二、重组DNADNA的转化及转化子的筛选的转化及转化子的筛选实验原理实验原理: 转化(Transf

14、ormation)：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。 重组DNA转化：DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 感受态(Competence)：通过人工诱导的方法，使自然状态下无法发生转化的细菌，如大肠杆菌，处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态，从而使转化得以高效率地进行。 转化子(Transformant)：即转化后的受体菌,又叫重组子。重组子在培养环境中形成的克隆称为阳性克隆，外源DNA可在阳性克隆中大量扩增、繁殖、保存以及表达目的基因产物。质粒质粒

15、DNADNA转化大肠杆菌：转化大肠杆菌： DNA分子转化步骤：吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面；转入：双链DNA分子解链，一条链进入受体菌，另一条降解；自稳：外源质粒DNA分子的细胞内复制成双链；表达：供体基因随同复制子同时复制、分裂、转录翻译。 转化效率：105107转化子/g DNA。获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。感受态细胞能接受外来感受态细胞能接受外来DNA 分子的机制分子的机制 局部原生质体化假说局部原生质体化假说细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： 发芽的芽孢杆菌容易转化； 大肠杆菌的原生质体不能被噬菌

16、体感染，却能受噬菌体DNA 转化； 适量的溶菌酶能提高转化率。 酶受体假说酶受体假说感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是： 蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； 细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现； 分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。转化子的筛选方法：转化子的筛选方法： 插入失活法 抗性筛选 蓝白筛选(互补法) 杂交筛选 免疫学筛选 酶切图谱鉴定 菌落PCR鉴定常用方法：常用方法： 抗性筛选法： 菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素、卡拉霉素等），这样只有转化子才能在含

17、该抗生素的培养基上长出。 互补法： 许多载体（如pUC系列 ）含有一个大肠杆菌-半乳糖苷酶基因(lac z基因)的短区段，其中含有lac z的调控序列和头146个氨基酸编码区，这个编码区中插入一个多克隆位点。而受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。当没有外源基因插入时，二者融为一体后，有-半乳糖苷酶表达，它能水解培养基中生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆位点，造成插入失活，从而使lac z基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同可以区分重组子和非重组子。X-gal + IPTG + AMPwith lacZ = blue

18、colony实验材料实验材料 LB培养基 质粒pCDNA3-p38连接产物（含Amp抗生基因） CaCl2 0.1M Amp DH5 大肠杆菌 感受态细胞制备感受态细胞制备1. 将宿主菌DH5 大肠杆菌在琼脂培养基平板上划线，37培养1620h。2. 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37震荡过夜。3. 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37震荡培养45h，测A600达0.40.5。4. 培养物冰上放置10min。5. 转入一50ml离心管，于4000rpm下4离心10min。6. 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2，置冰上10min。7. 5000rpm 4离心10min，弃上清。8. 加入300 l 0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，于4过夜。转转 化化 1. 在1.5ml Eppendorf管中加入100 l感受态细胞和10l pCDNA3-p38 DNA连接反应液，温和混匀，置冰上30分钟。2. 42水浴4560秒。3. 立即冰浴2分钟。4. 加入900 l LB培养液，37孵育60分钟。5. 10000rpm 离心15秒，吸去800上清。用剩余200 l