文-多肽的固相合成及固相反应在多肽合成中的应用

1、-2021 届：O622.5 单位代码：10452毕业论文多肽的固相合成及固相反响在多肽合成中的应用姓 名 薛立英学 号 3 年 级 2021级专 业 制药工程 系 院药学院指导教师 振 冀伟 2021 年4月10日. z-摘 要为研究多肽的固相合成工艺，并为工业化合成目标多肽提供理论依据。本实验采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-Trt树脂作为固相载体，以FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH和FMOC-L-PRO-OH为原料合成目标产物五肽，将反响时间和反响温度作为控制反响的条件。实验得出最适合的合成条件为，0投入反响，在室温下分别搅拌5h，过夜；目标产物五肽的最

2、终纯度可达100.0%。该合成方法操作简便、产率高，可用于工业化合成多肽。关键词：2-Cl-Trt树脂；固相载体；FMOC-L-LYS(Boc)-OH；FMOC-L-ALA-OH；有机合成；FMOC-L-PRO-OHABSTRACT To study the artwork of solid phase synthesis of polypeptide,and to provide the theoretical basis for industrialization synthesis of objective polypeptide.Using Fmoc solid phase synth

3、esis method,with 2-Cl-Trt resin as solid phase carrier,and with FMOC-L-LYS(Boc)-OH、FMOC-L-ALA-OH and FMOC-L-PRO-OH as raw material to synthesis of target products.The orthogonal e*periments were put forward by discussing and paring some reaction conditions such as time and temperature.Results:Optima

4、l conditions:0in reaction,respectively mi*ing five hours,at room temperature for the night.This method is easy to operate and has high product rate,can be applied on the large scale.Key words:2-Cl-Trtresin;solidphase carrier;FMOC-L-LYS(Boc)-OH;organic synthesis;FMOC-L-ALA-OH;FMOC-L-PRO-OH. z-目录1 引言1

5、2 实验局部22.1 主要试剂、仪器和其他物品22.1.1 实验试剂22.1.2 实验仪器32.1.3 其他物品32.2树脂的选择32.3 合成方法32.3.1 总反响方程式32.3.2 以 FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料32.3.3 以FMOC-L-ALA-OH为原料42.3.4 以FMOC-L-PRO-OH为原料42.3.5 树脂的切割42.4 LC-MS检测分析43 结果与讨论53.1 图谱分析53.2 讨论114 结语11参考文献12辞13. z-1 引言多肽是一种涉及生物体各种细胞功能的生物活性物质，它是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成，其分子构造介于氨

6、基酸和蛋白质之间的一类化合物。到目前为止，人们已经发现和别离出存在于人体的肽大约有一百多种，对于多肽的研究和利用，已到了史无前例的高度。多肽的合成主要是指化学合成法，其中最主要的合成方法是液相合成和固相合成。现在，化学合成多肽的技术无论是固相法还是液相法都已经成熟。而且近年来，固相法合成多肽凭借其节省时间、物力、原料，易于用计算机分析，易于推广普及等显著优势而成为合成多肽的常用方法并扩展到其它有机物合成的领域。 多肽固相合成法1英文解释：solid phase peptide synthesis 简写为SPPS。多肽合成研究已经有一百多年的历史了。此方法起于1902年，但到了20世纪50年代，

7、有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，例如胰岛素、催产素等，同时在多肽合成方法以及选择适宜的氨基酸保护基上面也取得了不少的成绩，这为后来的固相合成方法的出现与开展提供了实验和理论根底。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法并迅速成为合成多肽的首选方法。但在合成多肽的过程中，由于氨基酸的侧链功能团易带来一系列的的副反响和消旋化，所以一般需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。目前固相合成多肽主要用两种保护基16：Boc叔丁氧羰基保护基和Fmoc9-芴甲氧羰基保护基。其中-氨基用Boc叔丁氧羰基保护的称为Boc固相合成法，-氨基用Fmoc9-芴甲氧羰基保护的称为Fmoc固相合

8、成法。而且这两种方法在固相合成树脂，多肽缩合试剂以及合成环肽的氨基酸正交保护上均取得了丰硕的研究成果。多肽合成其实就是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端C端向氨基端N端合成。过去的多肽合是在溶液中进展的，但自从成功开展了固相多肽合成方法以来，经过几十年不断的改进和完善，到现在固相合成法已经成为合成多肽和蛋白质的一个常用方法，它的许多方面是传统液相合成方法无法做到的。固相合成多肽的根本原理是17：以不溶性高分子树脂作为固相载体，首先在固相载体上以共价键连接一个含有被封闭基团保护的氨基的氨基酸，然后以三氟乙酸作为脱保护剂，脱掉氨基的保护基，这样在固相载体上就连接上了第一个氨基酸。将上了保护

9、基的第二个氨基酸的羧基通过用过量的活化羧基组分活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体上的第一个氨基酸的氨基反响形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复缩合洗涤去保护中和和洗涤下一轮缩合操作，使肽链从C端向N端生长，直至到达所需要的肽链长度。最后用三氟乙酸将合成好的多肽从树脂上切割下来。与液相合成多肽的方法相比，固相合成法合成多肽所具有的显著优点是710：操作简单，大大简化了后处理操作的步骤；由于反响在单口烧瓶等玻璃容器中便可进展，便于控制反响条件，还可防止因物质的屡次转移而造成的损失；使用的反响物需过量，使反响完全，减少副产物，使得目标产物得到高产率和高纯度；与固

10、相载体以共价键相连的肽链比较稳定，可以通过抽滤、洗涤来完成中间产物的纯化，可以防止液相法合成多肽中复杂的步骤，防止别离纯化中间产物时而造成的损失；增加溶剂化效率，减少中间产物的损失；能防止肽的重叠。虽然采用固相法合成多肽已经有40多年的历史了，然而到现在，固相合成多肽仍然存在的许多的局限性36：固相合成法直接合成的多肽序列短，合成所需时间过长，合成的效率低，使用的试剂毒性较大，产生的副产物不易别离，氨基酸易消旋化，而且合成所需本钱过高，所以无法合成肽链较长、相对分子质量较大的蛋白质类物质；由于固相载体上中间合成产生的杂肽无法被别离掉，这样就造成最终产物的纯度有时不如液相合成物的，因此需要通过可

11、靠的别离手段进展纯化。现在，多肽固相合成法在生物制药工程及蛋白质工程中均有着广阔的开展应用前景。多肽固相合成法在免疫学研究领域、药物研究领域、蛋白质构造研究领域等都呈现着显著的优越性。由于在治疗*些比较棘手的疾病方面，多肽类药物所具有的独特治疗效果，使得越来越多的化学家和医学家来关注和研究，并取得了显著的研究成果。而且现今社会，随着合成技术的不断开展和成熟，合成仪器的不断改进和完善，可以合成蛋白质的围将不断扩大，合成时间将会显著缩短，合本钱钱也将会越来越低；同时通过多肽固相合成法，还可以引进稀有氨基酸，从而对新的蛋白质的构造与功能进展研究和探索。本论文就是采用Fmoc合成法合成多肽，研究了固相

12、合成多肽的实验过程，优化了合成步骤，并对实验结果进展了分析讨论。2 实验局部2.1 主要试剂、仪器和其他物品2.1.1 实验试剂2-Cl-Trt树脂美国Aldrich公司；FMOC-L-LYS(Boc)-OH9-芴甲氧羰基叔丁氧羰基左旋赖氨酸，美国Aldrich公司；FMOC-L-ALA-OH9-芴甲氧羰基左旋丙氨酸，美国Aldrich公司；FMOC-L-PRO-OH9-芴甲氧羰基左旋脯氨酸，美国Aldrich公司；MeOH甲醇，巴斯夫；DMFN，N-二甲基甲酰胺，巴斯夫；20%哌啶-DMF20%哌啶-N，N-二甲基甲酰胺，巴斯夫；DCM二氯甲烷，中国医药集团化学试剂公司；HCTU6-氯苯并三

13、氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯，A.R.吉尔生化；HOBt1-羟基苯并三氮唑，A.R.吉尔生化；1%TFA/DCM1%三氟乙酸/二氯甲烷，A.R.吉尔生化；DIEAN，N-二异丙基乙胺，A.R.吉尔生化。2.1.2 实验仪器500mL单口烧瓶兴运玻璃仪器制品厂；磁力搅拌器志威电器；磁子(市化玻供应公司；温度计兴运玻璃仪器制品厂；气球；布氏漏斗兴运玻璃仪器制品厂；滤纸；抽滤瓶兴运玻璃仪器制品厂；洗瓶；岛津瓶日本岛津公司；LC-MS液质联用仪LC-20AD，LCMS-2021EV，日本岛津公司；缓冲球贝凯生物化工设备；旋转蒸发仪BC-R203贝凯生物化工设备。2.1.3 其他物品铝箔；冰

14、；微波盒2.2树脂的选择固相载体是将固相合成与其他合成技术分开来的最显著的区别，能用于多肽合成的固相载体必须满足以下的要求1517：载体必须空间位阻小，便于溶剂的渗透，使其可以在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；载体上必须有足够的反响位点，能使氨基酸共价连接在这些位点上，并在合成反响完毕后，裂解这种共价键，以使得每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用；另外载体必须在合成中表现为反响惰性，对合成过程中的物理和化学条件稳定。固相法合成多肽的高分子载体树脂主要有三类7：聚丙烯酰胺类树脂、交联聚苯乙烯类树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物。只有将这

15、些树脂导入反响基团，才能直接连上第一个上了保护基的氨基酸。根据所导入反响基团的不同，又将这些树脂及树脂衍生物分为羧基树脂、氯甲基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。而本文采用的FMOC固相合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂作为固相载体，此次用的是2-Cl-Trt树脂。2.3 合成方法2.3.1 总反响方程式2.3.2 以 FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料其步骤是：将2-Cl-Trt树脂(1.00g，1.00mmol)和DIEA(516mg，4.00mmol)参加到无水的DCM (20mL)中混合，然后将 FMOC-L-LYS(Boc)-OH(1.40g，3.00mmol)溶于无水的DCM

16、(30mL)中，在0条件下，将后者参加到前者中，在室温下搅拌5小时。最后，将反响液进展抽滤，滤饼分别用DCM (30mL)，DMF (30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物中参加含有20%的哌啶-DMF30mL，在室温下搅拌过夜，以脱掉FMOC保护基。将反响液进展抽滤，滤饼分别用DMF(30mL)，DCM(30mL)洗涤三次，枯燥后得到产物A1。现象：滤液呈黄色，滤液加水有白色沉淀产生。2.3.3 以FMOC-L-ALA-OH为原料其步骤是：将FMOC-L-ALA-OH(933mg，3.00mmol) 参加到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mm

17、ol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和 DIEA(516 mg，4.00mmol的混合液在0条件下参加其中，并在室温下搅拌30min。将产物A11.00mmol溶于DMF (30mL)后参加到上述反响液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反响完成，则将反响液进展抽滤，滤饼分别用DCM (30mL)，DMF (30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。称1020mg吸附在树脂上的样品于微量离心管中，用1%TFA/DCM清洗树脂，抽滤。将滤液进展浓缩，假设残渣不溶于甲醇中则采取ELSD来检测反响是否完成。将上述所得产物中参加含有20%的哌啶-DMF30mL中，在室温下搅拌过夜

18、。将反响液进展抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)，DCM(50mL)洗涤三次，枯燥后得到产物A2。2.3.4 以FMOC-L-PRO-OH为原料 其步骤是：将FMOC-L-PRO-OH(3.00mmol)参加到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol)和DIEA(516 mg，4.00mmol的混合液在0条件下参加其中，并在室温下搅拌30min。将产物A21.00mmol溶于DMF(30 mL)后参加到上述反响液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反响完成，则将反响液进展抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DM

19、F(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物参加含有20%的哌啶-DMF30mL中，在室温下搅拌过夜。将反响液进展抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)洗涤三次，DCM(50mL)洗涤两次，枯燥后得到产物A3。 制备产物A4，A5的反响过程与制得A3的操作方法一样。2.3.5 树脂的切割将TFA(1%，10mL)参加到无水DCM20mL中，混合后产物A5参加到其中，在室温下搅拌1h。将反响液进展抽滤，然后滤液用与无水DCM20mL混合的20%DIEA来中和，测酸碱值，溶液浓缩后既得终产物。2.4 LC-MS检测分析本文用LC-MS液质联用仪来检测。色谱条件：流动相90%甲醇+10%

20、水；流速0.2mL/min)；扫描时间4min)；离子源模式：电喷雾电离ESI)，正离子模式；质量分析器：三重四级杆。方法：各阶段均取适量产物于微量离心管中，用甲醇稀释后混匀。取适量于岛津瓶中，送检，进样量为1L。图谱见图1、2、3 3 结果与讨论3.1 图谱分析A2的质谱图显示它的M:536.2、M+1:537.2与它的理论分子量相符；液相谱图显示它的积分面积即纯度为98.178%。见图1图1A4的质谱图显示它的M:864.3、M+1:865.3与它的理论分子量相符；液相谱图显示它的纯度为98.694%。见图2图2目标产物五肽的质谱图显示它的M：935.3、M+1:936.3与它的理论分子量

21、相符；液相谱图显示它的纯度为100.000%。见图3图33.2 讨论只有上第一个FMOC-L-LYS(Boc)-OH时使用的缩合剂是DIEA，后面上的带有FMOC保护基的氨基酸的缩合剂用的都是HCTU，HOBt，DIEA的混合液，这样可以有效地提高缩合效率。在肽链合成后，与多肽相连的树脂和侧链保护基团可以被切割试剂可以有效地切除。试验中使用的Fmoc固相合成多肽的方法，反响条件比较温和，副反响比较少，而且与以往的研究比较，本实验简化了工艺步骤，优化了反响条件，缩短了反响时间，可用于大量合成多肽。合成的多肽经质谱分析分子量为935.30与理论分子量935.50相一致。由图3可得目标产物五肽的最终

22、纯度可达100.000%。因此可以说明本次实验合成的多肽与理论计算的结果相一致。4 结语本论文通过固相载体的选择后以2-Cl-Trt树脂作为固相载体，以FMOC-L-LYS(Boc)-OH为起始原料，以以上各种上了保护基的氨基酸为中间原料合成了一条多肽，并探索了该多肽的性质、合成方法，通过实验研究反响物的加料比、所用溶剂、反响温度等各种因素对反响的影响，确定了此合成反响的较优条件。本文通过探讨多肽的合成方法，成功实现了目标化合物的合成，并通过LC-MS对各步反响产物及目标产物进展了纯度和构造的鉴定。本实验所探索的固相合成多肽的方法将为多肽的进一步研究提供理论依据和实验根底。参 考 文 献1香,

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