2015版《中国药典》微生物检查法控制菌检查法修订解析

1、2015年版中国药典微生物检查法控制菌检查法修订解析一、主要变化1.收载方式USP352010版版中国药典中国药典 2015版版中国药典中国药典Microbiological Examination of Nonsterile Products:Microbial Enumeration Tests微生物限度检查法非无菌产品微生物检查：微生物计数法Microbiological Examination of Nonsterile Products:Tests for Specified Microorganisms微生物限度检查法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法Microbiological

2、 Examination of Nonsterile Products:微生物限度检查法非无菌产品微生物限度标准一、主要变化 2.检查项目2010版版中国药典中国药典2015版版中国药典中国药典大肠埃希菌（E.coli）大肠菌群（Coliform）Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria沙门菌（Salmonella）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）金黄色葡萄球菌（S.aureus）金黄色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（

3、C.albicans）白色念珠菌（C.albicans）一、主要变化 3、对替代方法的认可：本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。新增内容 4、结果判断方式：在各控制菌项下，生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验。”改为较少的生化实验或“采用其它适宜的方法进一步鉴定。”较大变动二、通用要求 控制菌检查法适用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必

4、须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 供试液制备及实验环境要求同非无菌产品微生物检查：微生物计数法。 如果供试品具有抑菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物的无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。三、培养基适用性1、对照培养基 中国药典2010年版借鉴欧美药典，引入了培养基适用性检查以保障微生物限度检查结果的准确性和可靠性。但是，在药典修订过程中，对于欧美药典中的“之前验证过的培养基”的采纳与否，存在很大争议，主要集中在两点： 一、我国药品微生物实验室小而分散，数以千计的企业

5、和基层药检所难以有效地进行参比培养基的验证、评价工作； 二、在监督检查中，难以有效评估企业微生物实验室对参比培养基的验证情况。 经过第九届药典委员会微生物专业委员会的反复讨论，提出以统一的、经过充分评价和验证过的对照培养基替代需要由每个实验室分散评价的“之前验证过的培养基”。 三、培养基适用性1、对照培养基（1）培养基适用性检查试验可用于确定实验室所使用培养基（包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方使用不同批次的原材料自行配制培养基等）制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。

6、上述影响培养基质量的关键点应通过培养基适用性检查试验确定，如果其中有任何一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。但是，影响培养基质量的关键控制点的变化应掌握在微生物实验室质量控制的一般原则内，否则，无法通过培养基适用性检查确定。三、培养基适用性1、对照培养基（2）当检查结果出现异常或实验室质量控制需要，也可通过培养基适用性检查提供一定依据。在保证配制和灭菌过程无误的条件下，对照培养基可以不经适用性实验检查直接用于样品检查。（3）不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验简单确定。不能使用经过对照培养基进行适用性试验检查合格的其他培养基作为实验室自用的“对照培养基”。（4）如果没有特殊

7、规定，培养基配置采用蒸馏水或纯化水均可，但应进行检测控制，如蒸馏水pH应为57。三、培养基适用性1、对照培养基（5）尽量临用现配，培养基灭菌后，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留，固体培养基灭菌或融化后，融化状态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境225保存，但不应超过21d；固体琼脂培养基熔化再使用应不超过1次。（6）干粉培养基或培养基原料变质再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化应不再使用。三、培养基适用性2、工作菌种的制备3、菌悬液的获得方式4、适用性检查（1）控制菌检查用培养基数量减少7个；（2）在増菌过程，使用无选择性増菌培养基培养，是因为药品中的污染菌

8、受到加温、冷冻、酸碱、高渗等加工过程的影响，会受到不同程度的损伤。如果将供试品直接使用选择性増菌培养基培养，可以使受伤的细菌得到修复，提高检出率。三、培养基适用性4、适用性检查控制菌检查控制菌检查培养基培养基特性特性试验菌株试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌増菌肉汤促生长能力E.coli、P.aeruginosa抑制能力S. .aureus紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性E.coli、P.aeruginosa大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力E.coli抑制能力S. .aureus麦康凯琼脂促生长能力+指示特性E.coli沙门菌RVS増菌肉汤促生长能力S paratyphi B抑制能力S. .a

9、ureus木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力+指示特性S paratyphi BE.coli铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力P.aeruginosa抑制能力E.coli金黄色葡萄球菌甘露醇高盐琼脂促生长能力+指示特性S. .aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌増菌培养基促生长能力Cl.sporogenes哥伦比亚琼脂促生长能力Cl.sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力C.albicans沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性C.albicans三、培养基适用性4、适用性检查（1）测试能力：促生长能力（+）；抑制能力（-）； 指示能力（“指示”） 1）琼脂： 方法：

10、涂布，至少2皿。 比较菌落特征 是否生长 2）液体： 方法：直接接种 培养基是否浑浊 三、培养基适用性4、适用性检查（2）要求： 1）菌株：根据表格要求接种 2）接种量：根据测试指标而定 “+”和“指示”：不大于100cfu “-”：不少于100cfu，也不能过多。 涂布：不少于0.1ml接种，也不能过多。 3）培养时间 “+”和“指示”：不长于规定的最短培养时间。 “-”：不短于规定的最长培养时间。三、培养基适用性4、适用性检查（3）根据每个控制菌检查的培养基逐个说明，控制菌检查用培养基适用性检查的过程。（4）未注明培养温度，则默认为3035培养（5）测试菌简称后标示，测试指标，分别以上述“

11、+”“-”和“指示”标示。（6）简称： 1）大肠埃希菌：大肠 2）金黄色葡萄球菌：金葡 3）铜绿假单胞菌：铜绿 4）乙型副伤寒沙门菌：沙门 5）白色念珠菌：白念 6）生孢梭菌：生孢四、方法适用性试验 1、目的 微生物检验： 某种样品样品采用某种方法方法的到一个检查结果 供试品影响 方法的有效性 2、方法验证更名为方法适用性试验 方法切实有效 满足相应标准判断的需要 3、样品前处理四、方法适用性试验 4、试验菌中国药典2010年版中国药典2010年版修订版控制菌检查方法的验证控制菌检查方法的验证验证大肠菌群检查方法时，采取大肠埃希菌为验证菌株。方法适用性试验方法适用性试验试验菌 确认耐胆盐革兰阴

12、性菌检查方法时，采取大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。四、方法适用性试验 5、方法中国药典2010年版中国药典2010年版修订版验证方法验证方法：取规定量供试液及10100cfu试验菌接入増菌培养基中，依相应的控制菌检查方法进行检查。当采用薄膜过滤时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入増菌培养基或取出滤膜接入増菌培养基中。适用性试验适用性试验：按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cuf的实验菌接入规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入规定的培养基或去除滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度及最短时间下

13、培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。四、方法适用性试验 6、方法适用性试验结果判断中国药典2010年版中国药典2010年版修订版结果判断结果判断：若上述试验检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可以与供试品的控制菌检查同时进行。结果判断结果判断：过上述试验检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（非无菌产品微生物检查：微生物计数法中的“抗菌活性的去除

14、或灭活”）。 如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不可能存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。五、供试品检查 1、耐胆盐革兰阴性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria） 取代2010年版大肠菌群（Coliform）检查： 大肠菌群的定义是指在37生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的格兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌。它不是分类学上的名称。符合上述定义的菌除埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。 五、供试品检查 修订版： 1:10 TSB供试液（2025 2h

15、） 肠道增菌肉汤 紫红胆盐葡萄糖琼脂 （大肠、铜绿+/金葡-） （大肠、铜绿+且“指示”） 24-48h 18-24h 2010CHP: 取1:10供试液至乳糖胆盐发酵管（大肠+/金葡-）18-24h MaC琼脂（大肠+且“指示”）18-24h 乳糖发酵培养基（大肠+且“指示”）24-48h五、供试品检查 （1）供试液制备和预培养： 取供试品，用胰酪大豆胨肉汤做为稀释剂照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法” 制成1:10供试液，混匀，在2025培养，培养时间应使供试品种的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。 （2）未检出试验： 除另有规定外，取相当于1g或1ml供试品的上述预培养物接种至肠道菌

16、増菌肉汤中，3035培养24-48h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，3035培养18-24h。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐格兰阴性菌。五、供试品检查 （3）定量试验： 取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌増菌肉汤中，3035培养24-48h。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，3035培养18-24h。 （4）结果判断： 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，查表判断1g或1ml供试品中含耐胆盐革兰阴性菌的最

17、大可能数。五、供试品检查 “未检出试验”与“定量试验”结论耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数各供试品量的检查结果各供试品量的检查结果每每1g1g（或（或1ml1ml）供试）供试品种可能的菌数（品种可能的菌数（N N）0.1g/ml0.1g/ml0.01g/ml0.01g/ml 0.001g/ml0.001g/ml+N103+-102 N 103+-10 N 102-N 10五、供试品检查 2、大肠埃希菌 修订版： 取1:10供试液至TSB（适宜体积）（18-24h） MaC肉汤 MaC琼脂 （大肠+/金葡-） （大肠+且“指示”） 4244 24-48h 18-72h2010Chp 取1:10供试液至

18、胆盐乳糖増菌液（大肠+/金葡-）18-24h MUG培养基（大肠+且“指示”）5h、24h MaC琼脂（大肠+且“指示”）18-24h五、供试品检查 （1）供试液制备和増菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨肉汤培养基中，混匀，3035培养18-24h。（2010Chp中为胆盐乳糖培养基） （2）选择和分离培养 取上述预培养物1ml接种至100ml麦康凯肉汤中， 4244培养24-48h。取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养18-72h。（ 201

19、0Chp中为MUG培养基反应）五、供试品检查 （3）结果判断 若麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。五、供试品检查 3、沙门菌 修订版：10gTSB供试液（18-24h） RV肉汤 XLD琼脂 （沙门+/金葡-） （沙门+/金葡-） 18-24h 18-48h 2010Chp：10g营养肉汤供试液（18-24h） TTB SS/MaC琼脂 （沙门+/金葡-） （沙门+/金葡-） 18-24h 18-48h RV：氯化镁孔雀绿沙门菌增菌肉汤 XLD：木糖赖氨酸

20、脱氧胆酸琼脂 SS：沙门、志贺菌属琼脂 五、供试品检查 （1）供试液制备和増菌培养 取10g或10ml供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法学适用性试验确定）的胰酪大豆胨肉汤中，混匀，3035培养18-24h。（2010Chp为营养肉汤培养基） （2）选择和分离培养 取上述预培养物0.1ml接种至10mlRV増菌肉汤中，3035培养18-24h。取少量RV沙门菌増菌肉汤培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂平板上，3035培养18-48h。（2010Chp中前者在为TTB培养基，后者为胆盐硫乳琼脂（或SS琼脂）和麦康凯琼脂（或EMB琼脂）。 五、供试品检查 （3）结果判断: 若木糖赖氨酸脱氧

21、胆酸盐琼脂平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层有黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。 如果平板上没有菌落生长，或所有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色，或斜面黄色、底层无黑色，判断供试品未检出沙门菌。五、供试品检查 4、铜绿假单胞菌 修订版：取1:10供试液至TSB（18-24h） 溴化十六烷基三甲铵琼脂 （铜绿+/大肠-）18-72h 2010Chp：取1:10供试液至BL（铜绿+/金葡-）18-24h 溴化十六烷基三甲铵琼脂 （铜绿+/大肠-）18-24h 绿脓菌素测定用培养基 （铜绿+且“

22、指示”）24h五、供试品检查 （1）供试液之别和増菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨肉汤培养基中，混匀，3035培养18-24h。（2010Chp中为胆盐乳糖培养基） （2）选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，3035培养18-72h。（2010Chp中为18-24h）五、供试品检查 （3）鉴定试验 取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。 氧化酶试验：将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取上述平板上生长

23、的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验呈阳性，否则为阴性。五、供试品检查 （4）结果判定 若溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上有菌落生长，且氧化酶试验呈阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验呈阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。五、供试品检查 5、金黄色葡萄球菌 修订版：取1:10供试液至TBS（18-24h） 甘露醇氯化钠琼脂 （金葡+且“指示”/大肠-） 18-72h 2010Chp：取1:10供试液至营养肉汤或亚碲酸盐肉汤 亚碲酸盐肉

24、汤（金葡+/大肠-）18-24h 48h 甘露醇氯化钠琼脂 （金葡+且“指示”/大肠-） 18-72h 抑制能力：大肠埃希菌接种量不大于103，接种量过大时 大肠埃希菌可生长。五、供试品检查 （1）供试液制备和増菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨肉汤培养基中，混匀，3035培养18-24h。（2010Chp中为亚碲酸钠肉汤或）。 （2）选择和分离培养 取上述预培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，3035培养18-72h。（取消了2010Chp中卵黄氯化钠培养基）

25、五、供试品检查 （3）结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，验证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。五、供试品检查 6、梭菌 修订版同2010版：取1:10供试液至梭菌増菌培养基 （生孢+） 48h 哥伦比亚琼脂 （生孢+） 48-72h （1）供试液制备和热处理 取供试品，照“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”制成1:10供试液。取相当于1g或1ml供试品的供试液2份，其中1份置80 保温10分钟后迅速冷却。五、供

26、试品检查 （2）选择和分离培养 将上述2份供试液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的梭菌培养基中，置厌氧条件3035培养48h。取上述每一培养物少量，分别涂抹接种于哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下3035培养48-72h。（2010Chp中为含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基） （3）过氧化氢酶试验 取上述平板上生长的菌落，置干净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验呈阳性，否则为阴性。五、供试品检查 （4）结果判断 若哥伦比亚琼脂平板上有带或不带芽孢的厌氧杆菌生长，且过氧化氢酶反应呈阴性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为梭菌；如果哥伦比亚琼脂平板上没有厌氧杆菌生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但鉴定结果为阴性，或过氧化氢酶反应阳性，判供试品未检出梭菌。五、供试品检查 7、白色念珠菌 修订版基本同2010Chp：取1:10供试液至SDB 修订版：（白念+）3-5d 2010Chp：（白念+）48-72h 沙氏葡萄糖