1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个

1、1.荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在 PIO nm 之间，且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光 团的吸收光谱有重叠，当供体被入射光激发时，可通过偶极-偶极耦合作用将其能量 以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光，受体分子由基态 跃迁到激发态，再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移 (fluorescenceresonance energy transfer, FRET)。优点1. 适用于活细胞和固定细胞的各类分子，2. 灵敬度和分辨率高，并能清晰成像，3. 准确度高，操作简便4. 最直观地提供蛋口质相互作用的定位和定量信息，缺点首先,FRET 对空间构

2、想改变十分敬感,其测量范围在 P10 nm,但如果待测蛋口 原本就相当接近，FRET 信号已经达到最大值，此时一些刺激引起的微小的构想改变 就可能无法引起 FRET 信号的很大改变；其次，存在光漂口作用，FRET 需要起始激发光激发 D,这时就很难避免对 A 的 间接激发，这样的交义激发降低了分析的灵墩性；第三,存在其他一些本底荧光的干 扰；另外，起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞，产生光毒性。这些缺点 很大程度上限制了 FRET 的进一步发展。2. 蛋口质双杂交技术原理以与调控 SUC2 基因有关的两个蛋口质 Snfl 和 Snf2 为模型，将前者与 Gal4 的 DB结构域融合，另外

3、一个与 G&14 的 AD 结构域的酸性区域融合。山 DB 和 AD 形 成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵” (bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在 Snfl 和 Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个 融合蛋口上的 DB 和 AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的 转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报 道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。酵母双杂交系统的优点及局限双杂交系统

4、的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道 株的酵母双杂交系统具有许多优点：1易于转化、便于回收扩增质粒。2具 有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易同 来源于哺乳动物的蛋口结合。 一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子 的 DA-结合结构域(如GAL4-bd, LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如 GAL4-ad, VP16)o 激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系 中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达

5、(如 lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交系统在分析蛋口一蛋口间相互作时的优点：(1) 检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实悄况。(2) 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省 去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋口质之 间的微弱的或暂时的相互作用。(4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建 cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋口等多种不同亚细胞部位及功能的蛋 白。(5) 分析新基因的生物学功能，用未知功能的基因去筛选文库，然后根据钓到的 已知基

6、因的功能推测新基因的功能。缺点(1) 双杂交系统分析蛋口间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋口间的相互 作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在细胞核内无法进行。(2) 酵母双杂交系统的“假阴性”(3) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。3. 噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术是利用基因工程手段将合成的一组一定长度的随机序列寡核昔酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋口的 形式呈现在丝状噬菌体表面。进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋口质的噬 菌体。优点不受样品量限制，可人工扩增，类似 PCR 对 DNA 的扩增融合 U 的蛋口的噬菌体被分泌出胞外，免去了细胞

7、破碎、提纯等物理化学步骤, 保持了蛋白的天然构象可进行反复筛选，对 U 的蛋口进行春花和富集缺点山于受大肠杆菌转化效率的限制，一般肽库的容量只有 109,所以高于这一 限制的基因将难以表达。从建库开始，密码子的选择与寡核昔酸的合成，即编码肽的基因就带有一定 的偏爱性，这就从先天决定了肽库复杂度即多样性的局限性。作为噬菌体的宿主，大肠杆菌的生物合成系统有本身的表达限制，如不能进 行氨基酸的修饰。4. 蛋口质的亲和色谱原理色谱乂叫层析。亲和层析属于吸附层析的范畴，根据不同物质在同一吸附剂上 的吸附能力不同进行分离，将样品放入基质中，经展开，吸附能力差的迁移快,吸附能 力强的迁移慢，达到分离的 U 的。优点利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质，不 但能可以用来分离一些含量极微的物质，而且可以分离那些性质十分相似的生化物 质。缺点载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难，有的配基本身需要分离 纯化，步骤繁琐。5. 亲和印迹原理印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相