现代色谱分离技术中国海洋大学ppt课件

1、现代色谱分别技术现代色谱分别技术中国海洋大学医药学院中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室海洋药物教育部重点实验室李国强李国强 For For 博兴京博控股股份博兴京博控股股份2019-12-202019-12-20主要内容主要内容薄层色谱薄层色谱TLC 柱色谱柱色谱CC2 高效液相色谱高效液相色谱HPLC3 一 薄 层 色 谱引引 言言 薄层色谱(Thin Layer Chromato-graphy)，又称薄层层析，常用TLC表示。 将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的外表上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分别的物质展开。固定相：吸附剂。固定相：吸附剂

2、。流动相：展开剂。流动相：展开剂。分别原理：吸附与解吸附。分别原理：吸附与解吸附。薄层板v固定相：硅胶为运用最广泛的薄层资料。固定相：硅胶为运用最广泛的薄层资料。v 除此之外还有氧化铝、硅藻土等。除此之外还有氧化铝、硅藻土等。v常用薄层硅胶的特征：常用薄层硅胶的特征：硅胶商品名硅胶商品名称称黏合剂黏合剂荧光添加剂荧光添加剂应用应用硅胶硅胶H H无无无无薄层色谱，柱色谱薄层色谱，柱色谱硅胶硅胶G G有有无无薄层色谱，柱色谱薄层色谱，柱色谱硅胶硅胶GFGF254254有有有有在在254nm紫外灯下看荧光紫外灯下看荧光薄层板的制备方法湿法：平铺法和涂铺法。 制备薄层色谱制备薄层色谱 定性薄层色谱定性

3、薄层色谱 运运用用目目的的薄层色谱分类一定性薄层色谱一定性薄层色谱点点 样样展展 开开定位与显色定位与显色 1 点样v 样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶剂，最好选用与展开剂极性类似的溶剂。剂，最好选用与展开剂极性类似的溶剂。v 点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。v 点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度等要素有关，假设因样品溶液太稀，可反复点样。等要素有关，假设因样品溶液太稀，可反复点样。v 点样位置：距底边约点样位置：距底边约1-

4、2cm的起始线上，点与点的间隔的起始线上，点与点的间隔为为0.5-1cm。v 点样方式：定性分析点样方式：定性分析-点状点样。点状点样。v 直径直径3-5mm的圆点的圆点v 制备薄层制备薄层-条状点样。条状点样。2 展开u石油醚石油醚u环己烷环己烷u四氯化碳四氯化碳u苯苯u氯仿氯仿u乙醚乙醚u乙酸乙酯乙酸乙酯u丙酮丙酮u乙醇乙醇u甲醇甲醇u水水u乙酸乙酸极极性性加加强强 展开剂选用原那么展开剂选用原那么1 对所需组分有良好的溶解性类似相溶。对所需组分有良好的溶解性类似相溶。2 可使成分间分开。可使成分间分开。3 待测组分待测组分Rf在在0.20.8之间。之间。常用展开剂体系常用展开剂体系一元：

5、石油醚，甲醇一元：石油醚，甲醇 等。等。二元：石油醚：丙酮，石油醚：乙酸乙酯，二元：石油醚：丙酮，石油醚：乙酸乙酯， 氯仿：甲醇氯仿：甲醇 等。等。三元：氯仿：甲醇：水三元：氯仿：甲醇：水 等。等。应留意：应留意：a a 展开剂不淹没样点。展开剂不淹没样点。b b 薄层板呈倾斜状。薄层板呈倾斜状。C C 展开过程应在密闭容器展开过程应在密闭容器中进展。中进展。d d 展开剂前沿上升到一定展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快标出高度时取出，尽快标出展开剂前沿位置，以便展开剂前沿位置，以便计算计算RfRf值。值。2 展开l 展开后将溶剂吹干。展开后将溶剂吹干。l 常见的定位方法：常见的定位方法：3

6、 定位与显色光学检出法光学检出法254nm，365nm运用方便，被检测物不易被破坏蒸气检出法蒸气检出法展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充溢碘蒸气的密闭展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充溢碘蒸气的密闭容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。试剂检出法试剂检出法利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反响利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反响通用显色剂：通用显色剂：10%硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。(二二)制备薄层色谱制备薄层色谱PTLC特点：特点：1 较分析薄层样品液的浓度大。较分析薄层样品液的浓度大。

7、2 板较大，较厚吸附剂用量多板较大，较厚吸附剂用量多3 点样多点成直线。点样多点成直线。用于制备的薄层色谱。用于制备的薄层色谱。样品的检测v 有色物质直接察看斑点。v 荧光物质紫外灯下察看。v 如必需采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块玻璃板盖住，留出一条进展显色，将需求的部分作出记号。样品的搜集v切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。v回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用极性尽能够低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常极性尽能够低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常用。用。TLCTLC的特点的特点v方法简便易行方法简便易行, ,价钱低廉；价

8、钱低廉；v分析快速；分析快速；v检出灵敏度高；检出灵敏度高；v分别才干强；分别才干强；v检测手段多样化；检测手段多样化；v运用广泛；运用广泛； 二 柱 色 谱柱色谱柱色谱硅胶柱色谱硅胶柱色谱凝胶柱色谱凝胶柱色谱 ODS ODS柱色谱柱色谱大孔树脂柱色谱大孔树脂柱色谱(一)硅胶柱色谱 1 原理：原理： 根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分别。普通情况下极性较大的物质易被硅分别。普通情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组分以不同的速率向下挪流动相流过时各组分以不同的速率向下挪动，吸附弱的组

9、分随着流动相挪动在前面，动，吸附弱的组分随着流动相挪动在前面，吸附强的组分挪动在后面，各种化合物在吸附强的组分挪动在后面，各种化合物在色谱柱中构成带状分布，实现化合物的分色谱柱中构成带状分布，实现化合物的分别。别。1 1 吸附剂的选择吸附剂的选择硅胶硅胶G G 100200 100200目拌样用目拌样用 200300 200300目上柱用目上柱用硅胶硅胶H H 2 2 预备任务：预备任务：2 2 色谱柱的选择色谱柱的选择下端有活塞的玻璃柱下端有活塞的玻璃柱 柱子大小视分别样品的量柱子大小视分别样品的量而定而定3 3 洗脱剂的选择洗脱剂的选择 洗脱剂多普通由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，经

10、洗脱剂多普通由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，经过不同的配比调理溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。过不同的配比调理溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。初始洗脱剂配比的选择：薄层实验，使待分别组分的初始洗脱剂配比的选择：薄层实验，使待分别组分的RfRf值介值介于于0.10.20.10.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。3 3 操作步骤操作步骤加样洗脱检测合并装柱装柱 将色谱柱洗净、枯燥，底部塞一小块脱脂棉。将色谱柱洗净、枯燥，底部塞一小块脱脂棉。1 1干装法：将硅胶经过小漏斗倒入柱内，应不延续地干装法：将硅胶经过小漏斗倒入柱内，应不延续地构成

11、一细流渐渐参与柱内，同时用橡皮槌悄然敲打色谱柱，构成一细流渐渐参与柱内，同时用橡皮槌悄然敲打色谱柱，使装填均匀。柱装填好后，翻开下端活塞，从上端倒入洗使装填均匀。柱装填好后，翻开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保管一定液面。脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保管一定液面。2 2湿装法：将硅胶参与适量最初运用的洗脱剂，超声湿装法：将硅胶参与适量最初运用的洗脱剂，超声搅拌，调成混悬液，翻开柱子下端活塞，徐徐将混悬液倒搅拌，调成混悬液，翻开柱子下端活塞，徐徐将混悬液倒入柱子，使洗脱剂渐渐流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下端。入柱子，使洗脱剂渐渐流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下端。待加完吸附剂后，继

12、续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉降不待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉降不再变动。留意整个操作过程要渐渐进展，不要将气泡压入再变动。留意整个操作过程要渐渐进展，不要将气泡压入硅胶中，而且要一直坚持吸附剂上端有溶剂，切勿流干。硅胶中，而且要一直坚持吸附剂上端有溶剂，切勿流干。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上面坚最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上面坚持有持有1cm1cm高液面为止，关上活塞。高液面为止，关上活塞。装柱装柱洗脱洗脱检测检测合并合并加样加样3 3 操作步骤操作步骤多采用干法加样拌样法：将样品用尽多采用干法加样拌样法：将样品用尽量少的易挥发溶剂溶解，参与

13、样品约量少的易挥发溶剂溶解，参与样品约5 5倍量倍量的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并在柱顶放一块圆形滤纸。在柱顶放一块圆形滤纸。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤将经过将经过TLCTLC选择好的洗脱剂参与选择好的洗脱剂参与分液漏斗或者加液球中，使之不分液漏斗或者加液球中，使之不断缓慢加于样品之上，留意一直断缓慢加于样品之上，留意一直坚持洗脱剂液面在硅胶之上，切坚持洗脱剂液面在硅胶之上

14、，切勿流干。勿流干。翻开色谱柱下端活塞，控制流速，翻开色谱柱下端活塞，控制流速，等份搜集洗脱液，也可用自动搜等份搜集洗脱液，也可用自动搜集器搜集。集器搜集。经过上端加压或者下端减压可以经过上端加压或者下端减压可以提高洗脱速度，但是能够会降低提高洗脱速度，但是能够会降低塔板数影响分别效果。塔板数影响分别效果。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤每份洗脱液采用薄层色谱法检查。每份洗脱液采用薄层色谱法检查。装柱装柱加样加样洗脱洗脱检测检测合并合并3 3 操作步骤操作步骤成分一样斑点一样的洗成分一样斑点一样的洗脱液合并，回收溶剂。脱液合并，回收溶剂。 1 2 3 4 5 6

15、 7小极性的组分先被洗脱下来小极性的组分先被洗脱下来大极性组分后被洗脱下来大极性组分后被洗脱下来二凝胶柱层析二凝胶柱层析1 原理2 凝胶层析中常用的凝胶琼琼脂糖凝脂糖凝胶胶聚丙聚丙烯酰胺烯酰胺凝凝胶胶葡聚糖凝葡聚糖凝胶胶Sephadex3 凝胶柱的运用 溶溶 胀胀 装装 柱柱上上 样样洗洗 脱脱羟丙基葡聚糖凝胶羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20Sephadex LH-20为干粉，装柱前量为干粉，装柱前量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重，好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重， 称重后足量称重后足量用有机溶剂常用氯仿：甲醇用有机溶剂常用氯仿：甲醇=1=1：1 1溶胀。溶胀。将层析柱垂

16、直固定在铁架上，翻开柱下口开关。将溶胀好将层析柱垂直固定在铁架上，翻开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶外表的水层与凝胶体积相等。的凝胶放在烧杯中，使凝胶外表的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边参与搅匀的凝胶，可见凝胶延续均匀地边排水，上口一边参与搅匀的凝胶，可见凝胶延续均匀地沉降，逐渐构成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立刻封沉降，逐渐构成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立刻封锁下口，使凝胶完全沉降。锁下口，使凝胶完全沉降。湿法上样：湿法上样： 翻开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多

17、余溶液，翻开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液，使液面与凝胶外表相平齐。使液面与凝胶外表相平齐。 将样品加在凝胶外表，翻开下口开关，控制流速，使样品将样品加在凝胶外表，翻开下口开关，控制流速，使样品渐渐渗入凝胶内。当渐渐渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面渐渐渗入凝胶内。当渐渐渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，封锁下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层相平齐时，封锁下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层35cm洗脱液，接上洗脱瓶预备洗脱。洗脱液，接上洗脱瓶预备洗脱。控制流速，过快或过慢影响分别效果。控制流速，过快或过慢影响分别效果。流出液分步搜集，分析、合并。流出液分步搜集，分析、合并

18、。1 1 原理：原理： 大孔树脂为新型非离子型分子聚合物大孔树脂为新型非离子型分子聚合物吸附剂，白色球形颗粒，每个颗粒都是由吸附剂，白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，称许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，称之为之为“大孔。大孔。 三大孔树脂柱色谱三大孔树脂柱色谱 大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和挑选作用，经过选用适宜的吸附和解析条件以分别、提纯某一或某一类化合物的色谱。 可分为极性、中极性、非极性三大类，根据分别物质极性的大小，经过所选择的与之相顺应的大孔树脂的选择性吸附而到达分别目的。2 2 特点特点v理化性质稳定。理化性质稳定。v分

19、别性质优良。分别性质优良。v溶剂用量小。溶剂用量小。v可反复运用。可反复运用。v对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，对色素吸附作用较强。对色素吸附作用较强。3 操作步骤预处置预处置上样上样洗脱洗脱再生再生乙醇浸泡乙醇浸泡24h ，充分溶胀，充分溶胀湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等量蒸馏水无白色浑浊量蒸馏水无白色浑浊 蒸馏水洗至无醇味且水液廓清。蒸馏水洗至无醇味且水液廓清。将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进展吸附。将样品溶于少量水中，以一定的

20、流速加到柱的上端进展吸附。上样液以廓清为好，上样前要配合一定的处置任务，如上样液上样液以廓清为好，上样前要配合一定的处置任务，如上样液的预先沉淀、滤过处置、的预先沉淀、滤过处置、PH调理，使部分杂质在处置过程中调理，使部分杂质在处置过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入废品。除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入废品。普通先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进展洗脱，并控制洗普通先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进展洗脱，并控制洗脱液的用量与流速，使提取液由上而下经过树脂柱。搜集、合脱液的用量与流速，使提取液由上而下经过树脂柱。搜集、合并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空枯燥，得精制并洗脱液，减

21、压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空枯燥，得精制产品。产品。95%乙醇洗脱至无色，再用乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再盐酸浸泡，用水洗至中性，再用用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。浸泡，再用水洗至中性。(四) ODS反相柱层析1 1填料填料: : ODS(octadecyl bonded ODS(octadecyl bonded silica) ,silica) ,十八烷基键合硅胶，是十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质键合的以硅胶为基质键合的C18C18填料填料, , ODSODS适用于分别中等偏大的化合物。适用于分别中等偏大的化合物。 与与HPLCHPLC不同，开放式不同，开放式

22、ODSODS是是将将ODSODS装入玻璃柱内，不加压或者装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵加压。用加压泵加压。2 操作步骤将将ODS用甲醇浸用甲醇浸泡，详细装柱方法泡，详细装柱方法与硅胶柱一样。与硅胶柱一样。用甲醇装柱完成用甲醇装柱完成后，置换成起始流后，置换成起始流动相系统。动相系统。装柱装柱上样上样洗脱洗脱湿法：用起始流湿法：用起始流动相溶解样品装柱动相溶解样品装柱。干法：对于一些干法：对于一些溶解性较差的样品溶解性较差的样品，用挥发性溶剂拌，用挥发性溶剂拌入入ODS中，挥干中，挥干溶剂。溶剂。常用梯度洗脱：常用梯度洗脱：10%甲醇甲醇/水水 30%甲醇甲醇/水水 50%甲醇甲醇/水水 70

23、%甲醇甲醇/水水 90%甲醇甲醇/水水 100%甲醇。甲醇。根据样品情况细分根据样品情况细分调整。调整。 三 高效液相色谱引引 言言 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。法。HPLC是以经典的液相柱色谱为根底，是以经典的液相柱色谱为根底，流动相改为高压保送，采用高效固定相及在流动相改为高压保送，采用高效固定相及在线检测等手段，开展而成的分别分析方法。线检测等手段，开展而成的分别分析方法。该法具有分别效能高、分析速度快及仪器化该法具有分别效能高、分析速度快及仪器化等特点，因此称为高效液相色谱法。等特点，因此称为高效液相色谱法。一一 HPLC HPLC任务原理任

24、务原理检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次搜集起来，制成纯品，供进一步化学定性和构造鉴定。搜集起来，制成纯品，供进一步化学定性和构造鉴定。液相色谱柱分类正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶外表键合-CN,-NH2等官能团。反相柱：以硅胶为基质，在其外表键合碳十八ODS 、碳八、碳四等官能团的非极性填料。制备型制备型HPLCHPLC 分析型分析型HPLCHPLC 二二 HPLC HPLC分类分类运运用用目目的的 分析型分析型HPLCHPLC制备型制备型HPLCHPLC分析分析HPLCHPLC制备制备HPLCHPLC色谱柱 柱内径15mm柱内径11

25、0mm（或更大）进样量仅够检测用即可尽可能加大进样量目的获得样品组成信息，研究大部分或全部样品组分纯品的制备，只对一种或几种样品组分感兴趣。检测DAD全波长检测，以保证色谱峰分离度分析HPLC确定条件后VWD单波长检测即可分析分析HPLCHPLC与制备与制备HPLCHPLC比较比较三三 HPLC HPLC的运用的运用初步初步纯化纯化优化优化 色谱条件色谱条件 分析分析HPLCHPLC制备制备( (制备制备HPLC)HPLC)未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有大量能够在填料外表不可逆吸附的组分，直大量能够在填料外表不可逆吸附的组分，直接进样，可导致昂贵的

26、填料很快失效。接进样，可导致昂贵的填料很快失效。此外，大量的杂质降低对目的产物的分别度，此外，大量的杂质降低对目的产物的分别度，因此限制了进样量和消费效率。因此限制了进样量和消费效率。因此，因此，HPLCHPLC前利用薄层色谱、柱色谱等进展前利用薄层色谱、柱色谱等进展初步纯化很有必要。初步纯化很有必要。常用流动相：甲醇：水常用流动相：甲醇：水( (酸水酸水) ) 乙腈：水酸水乙腈：水酸水常用色谱柱：常用色谱柱：C18C18，C8 C8 半制备柱半制备柱 波长：全波长分析，确定最优制备波长。波长：全波长分析，确定最优制备波长。目的：经过改动流动相的配比，在尽量短的时目的：经过改动流动相的配比，在

27、尽量短的时 间内，使目的组分的分别度到达间内，使目的组分的分别度到达1.51.5。按用分析按用分析HPLCHPLC确定的色谱条件，确定的色谱条件，逐渐增大进样量，经过监测检逐渐增大进样量，经过监测检测谱图，依次搜集洗提液，制测谱图，依次搜集洗提液，制成纯品。成纯品。min051015202530mAU05001000150020002500 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 B, Sig=230,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 C, Sig=210,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 D, Sig=320,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D) DAD1 E, Sig=280,10 Ref=360,10 (ZHY11051001.D)min0510152025mAU0100200300400500600 DAD1 A, Sig=254,10 Ref=360,10