隆线溞夏卵胚胎发育过程中形态及蛋白质,氨基酸组成和含量的变化

1、隆线溞夏卵胚胎发育过程中形态及蛋白质,氨基酸组成和含量的变化摘要：本文系统地观察了隆线溞夏卵的胚胎发育.根据胚胎外部形态学特征,将其胚胎发育分为卵期,长胚期,双复眼期和单复眼期四个主要时期,并采用生物化学方法测定和分析了隆线溞夏卵胚胎发育过程中蛋白质和氨基酸的组成.实验得知，可溶性蛋白和氨基酸含量的变化趋势与隆线溞夏卵胚胎发育的特征密切相关，卵期可溶性蛋白和氨基酸含量呈下降趋势，而长胚期略有所上升，但从双复眼期至胚胎准备孵化期间又持续下降。随着隆线溞夏卵胚胎的发育，可溶性蛋白的组成由大分子量的蛋白向小分子量的蛋白转化；在所有的氨基酸中谷氨酸的含量最高，必需氨基酸中亮氨酸的含量最高。结果表明，蛋

2、白质和氨基酸是隆线溞胚胎发育过程中的主要营养物质，不仅用于胚胎发育组织和器官的构建，而且为胚胎发育提供能量。关键词：隆线溞；胚胎发育；蛋白质；氨基酸1引言枝角类（Cladocera）是一类优质天然饵料，研究枝角类的生长、发育和繁殖以进行规模化培养，对水产养殖业意义重大。在枝角类种群、生长、繁殖、发育及环境评价等方面，已有不少报道。对枝角类胚胎发育的研究，目前国内外学者多着眼于胚胎外部形态的发生，其发育过程中主要生化物质的变化则未见有相关报道。本文在研究隆线溞夏卵胚胎外部形态发生的基础上，对其不同发育时期蛋白质及氨基酸的组成和含量进行了测定和分析，以期为深入研究枝角类胚胎发育的机理积累基础资料，

3、也为生产上提高母溞的产卵量及幼溞的成活率提供理论依据。2材料和方法2.1 试验材料培养隆线溞溞种于 2003 年 2 月购于上海市大渡河路花鸟市场。鉴定后室温培养，饲以枝角类培养液（土壤 10.0g、兔子粪便 1.5g 和青菜2.0g 混合，加入 1L 水煮沸过滤）。根据水质状况定期更换培养液，使其大量繁殖。2.2 胚胎发育外部形态学观察选取未怀卵的成熟孤雌溞进行培养，每隔半小时观察其卵巢发育情况，待卵巢较为膨大时分离单独培养，在倒置显微镜下连续观察。母溞在蜕皮后即刻产卵，卵产入孵育囊后每隔一定时间拍照，测量胚胎的长度和宽度。卵排入孵育囊内 3h 后，小心将胚胎从孵育囊内取出，放在盛有蒸馏水的

4、小培养皿里，进行体外孵化、拍照和测量，直到幼溞从孵育囊内孵出。根据胚胎发育的形态学特征变化，对胚胎发育进行分期。2.3 胚胎发育各时期蛋白质的组成和含量测定取不同发育时期的胚胎，称湿重后加入 10 倍体积预冷的 PBS 溶液，冰浴匀浆，冷冻离心(12000rmin-1)30min，取上清液，分装保存。一部分用于胚胎可溶性蛋白含量的测定，另一部分用于胚胎可溶性蛋白组成和分子量的测定。胚胎可溶性蛋白含量的测定以牛血清白蛋白作标准，用考马斯亮蓝法测定，做 3 个平行组，取其平均值。胚胎可溶性蛋白组成和分子量的测定用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，方法如下：根据测得的胚胎各时期蛋白的浓度，用 PBS溶液

5、将各时期的蛋白溶液稀释成相同的浓度，各取 30L 在沸水浴加热 3min。电泳时用 15%的分离胶和 4%的浓缩胶，上样量为 20L，在电泳槽中加 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，60120V 电泳 2h，直到指示剂跑至胶板底部。用银染法染色。选用低分子量标准蛋白质，其组成为兔磷酸化酶 B(97400)、牛血清白蛋白(66200)、兔肌动蛋白(43000)、牛碳酸酐酶(31000)、胰蛋白酶抑制剂(20100)和鸡蛋溶菌酶(14400)。以标准蛋白分离胶起点到蛋白带中线距离作横坐标，标准分子量换算对数值作纵坐标，画标准曲线，然后根据待测蛋白迁移率计算蛋白分子量。2.4 胚胎发育各时期氨基酸组成和含

6、量的测定将各时期胚胎置于 70烘箱中烘干至恒重，精确称重后放入玻璃水解管中，采用盐酸消解法，在 H853-50型氨基酸自动分析仪上测定氨基酸的组成和含量。同时做 3 个平行组，取平均值。利用统计学方法计算氨基酸含量的平均值( X )、方差(S)和变异系数(CV)。3结果3.1 胚胎发育的外部形态学特征在水温 26下，从夏卵排入孵育囊到胚胎孵化，隆线溞胚胎发育共经历约 31h。根据胚胎发育的主要形态结构变化，将隆线溞夏卵的胚胎发育分为四个时期，其间又根据每个时期的发育特点，将隆线溞胚胎发育分为八个时期（-期）。3.1.1 卵期自夏卵排入孵育囊到外层卵膜破裂为止，共经历约 11h，可分为三个时期。

7、期 产出期。夏卵从卵巢排入孵育囊内，外包一层透明卵膜，长卵形，随之变圆，直径约 0.219mm。约半小时后，可见胚胎外围一圈较透明，卵内大部分区域较暗，不透明，中央有数个油滴状物。该时期持续约 2h(图版-1)。期 胚胎显著增大为卵圆形，长约 0.290mm，宽约 0.250mm。胚胎外围一圈更透亮，中央油滴状物愈加明显，数量增多。整个期持续约 3h(图版-2)。期 胚胎长约 0.299mm，宽约 0.259mm。此时明显可见内外两层卵膜，外围亮带逐渐消失，油滴状物不明显。约 2h 后，不透明的中央区域外周出现一圈球形的卵黄颗粒。持续约 45min 后，胚胎外围出现第一个凹陷，随后凹陷逐渐增多

8、，凹陷之间逐渐形成的许多突起，即为头原基和附肢原基等。整个期持续约h(图版-3)。3.1.2 长胚期胚胎从最外层卵膜破裂发育至出现两个红色眼点，共经历约8h，其间又可分为两个时期。期 胚胎不断长大，外层卵膜从一端开始快速破裂，瞬间将胚胎弹出，外层卵膜脱落。此时胚胎仍外包一层很薄的卵膜，即内层卵膜。胚胎开始纵向伸长，长约0.342mm，宽约 0.241mm。胚胎内卵黄颗粒量增多。中央的油滴开始消散。此时胚胎外围的头原基与附肢原基已清晰可辨，第二触角原基明显且分节。此后胚胎不断纵向增长，卵黄颗粒不断增多，并向头原基移动，头部增长明显。期持续约h(图版-4)。期 胚胎停止增长，随后开始收缩，胚内物质

9、与内层卵膜间间距增大，纵向收缩明显。经h 左右，胚胎与内层卵膜间隙达到最大，整个胚胎长约 0.364mm，宽约 0.250mm。此时胚胎头部已形成，五对胸肢原基和壳瓣原基已清晰可辨，第二触角内、外肢分开。随后胚胎又开始增长，与卵膜间的距离减小。约h后，第二触角变粗壮，卵黄颗粒向头部推进，壳瓣原基越发显著，将胸肢原基盖住。整个期持续约h(图版-5)。3.1.3 双复眼期胚胎出现两个红色的眼点发育至两个眼点愈合变黑，共经历h，其间可分为两个时期。期 胚胎头部出现一对红色眼点，二者分开。胚胎开始略微地旋转，30min 后，胚胎在纵向上已经将卵膜顶满，胚胎长约 0.386mm，宽约 0.259mm。此

10、时心脏在背部轻微博动，接着第二触角开始抖动。整个期持续约h(图版-6)。期 一侧的第二触角伸出卵膜，3min 后，另一侧的第二触角也伸出，此时第二触角发育基本完全，内、外肢均已分节，并有触角刚毛。整个胚胎开始不断运动。接着壳刺出现，两个红色眼点逐渐靠近，胚胎头部开始变尖。数分钟后，眼点更加靠拢，心脏博动加快，壳瓣基本发育完全，两侧伸长变为向腹面合抱，身体成为侧扁，此时胚胎长约 0.518mm，宽约 0.263mm。胚胎已经十分活泼，且能够快速游动。此期末，胚体中央卵黄颗粒逐渐变少；胚胎尾部向后突出；眼点逐渐愈合变黑。整个期持续约h(图版-7)。3.1.4 单个复眼期期 即准备孵化期，胚胎长约

11、0.536mm，宽约0.307mm。眼点已完全愈合变黑成单个复眼。弯曲的壳刺弹出，内膜脱落。身体中央的肠管已经基本成型。第二触角和胸肢已经长成，壳瓣变硬，边缘已出现小刺。胚胎发育成熟，即将从孵育囊内孵出成为第一龄幼体。此期约经历3h(图版-8)。3.2 胚胎发育各期可溶性蛋白质含量和组成的变化 3.2.1 可溶性蛋白含量的变化隆线溞夏卵整个胚胎发育过程中，可溶性蛋白含量总体呈下降的趋势（图 1）。在产出期，胚胎的蛋白含量最高，占样品湿重的 19.68。从产出期到第期蛋白含量迅速降低了 4.05%，到第期下降至 13.04%。但至长胚期（第、期），蛋白含量逐渐上升，分别升至 15.11%、17.

12、38%。随后的胚胎发育期，蛋白含量又逐渐下降，至准备孵化期下降到最低点，仅占胚胎湿重的8.80%，比产出期下降了 10.88%3.2.2 可溶性蛋白组成和分子量的变化隆线溞胚胎发育八个时期可溶性蛋白 SDS-PAGE 电泳结果表明(图 2)，从胚胎产出期至准备孵化期，电泳图谱上的条带逐渐增多，即可溶性蛋白的种类或组成都逐渐增加，但胚胎发育各时期主要蛋白的组成都极为相近，只是同分子量的蛋白条带在不同的发育时期含量不同。卵期的第、和时期，蛋白条带数明显较少，即蛋白质的种类相对较少，仅分子量在 105.6119.7KD 间的蛋白带含量特别高，而分子量小的蛋白条带不明显。其中，第期的蛋白质图谱中，分子

13、量约为 58.7KD 和 24.4KD 的两蛋白条带在后面几个时期未出现，即使出现含量也极低，第、时期蛋白组成基本相似。从长胚期开始，蛋白条带数明显增多。长胚期的第、时期除个别蛋白条带有差异外，大多数蛋白条带较为相似，仅含量有所差异，分子量在 106.6120.7KD 和 19.823.4KD 间的蛋白带含量较高。双复眼期的第、时期蛋白条带基本相一致，和长胚期一样在分子量约为 19.823.4KD 间的蛋白带含量较高。到单复眼期，即准备孵化期(期)，蛋白条带与前面几个发育时期差异较大，大分子量的蛋白条带(分子量66.2KD)明显减少，以小分子量(分子量4.3 隆线溞胚胎发育过程中氨基酸含量及组

14、成的变化和蛋白质含量变化趋势大体相同，隆线溞胚胎发育过程中总氨基酸的含量变化也大致呈下降趋势，这与两者的水解顺序，即氨基酸来源于蛋白质水解有关。总氨基酸含量在隆线溞胚胎发育的卵期呈下降趋势，而在长胚期略微升高，可能是胚胎经过快速卵裂，消耗了大量的营养物质，很可能利用这个休息期积累和合成一些关键营养物质(如氨基酸)，从而为胚胎进一步的快速发育作物质和能量准备，这与蛋白质含量在此时期增长的原因是相同的。总氨基酸含量从双复眼期到准孵化期呈下降趋势，可能是胚胎构建组织与器官消耗了大量的营养物质。隆线溞胚胎发育过程中必需氨基酸和非必需氨基酸的变异系数相对较大，其含量变化也较大，但总体呈下降趋势，与总氨基

15、酸的变化趋势大体相接近。在所检测的必需氨基酸中，亮氨酸 Leu 和赖氨酸 Lys 的含量最高(占总氨酸的5.06%和 3.94%)。这是因为生物体的代谢中，二者均可分解成乙酰辅酶 A 和乙酰乙酸，它们是沟通糖类与脂类代谢的重要中间物质。隆线溞胚胎内的非必需氨基酸中谷氨酸 Glu 含量最高，胱氨酸 Cys 最低。这是因为 Glu 可与水产动物的蛋白代谢物 NH3 结合，经谷氨酰胺酶分解成游离 NH3 排出体外；另外 Glu 在酶的催化下，可生成相应的酮戊二酸，而酮戊二酸又是三羧酸循环的关键中间代谢产物。Glu 很可能在胚胎发育时期沟通糖、脂、核酸、蛋白质代谢的三羧酸循环反应比较活跃，因此含量最高

16、。Cys 的疏基是一种不太稳定的基团，反应性能高，在胚胎发育的各种代谢活动中，或在氨基酸测定的过程中易转化成其它物质。因此 Cys 较大的变异系数且与总氨基酸的相关性不明显，很可能与其自身的特点有关。根据隆线溞胚胎形态发育以及胚胎发育过程中生化成分变化规律的研究，隆线溞胚胎发育的全部营养物质均是由卵巢累积的，为提高母溞的产卵量和幼溞的成活率，建议在母溞的培育中要保证充足的食物供给，以提高卵子的数量和质量；同时溞卵排入孵育囊后，尽可能保持水环境的稳定，以免发育未成熟的胚胎自孵育囊内排出，降低胚胎成活率。京都名师论文中心成立于 2000 年，是中国最顶级的论文工作平台，致力于为全国各类客户提供论文

17、指导、发表论文服务，以提供高品质职称论文服务为己任，是全国唯一一家依托北京各大高校学术资源、设置在北京大学校内的论文发表服务机构。一直以来，京都名师论文网致力于对高品质教师职称论文、教师职称论文范文的传承与传播，对中国高品质原创论文事业的推动，已得到社会各界的广泛认可和赞誉。参考文献1 施心路, 史新柏，微齿喜马拉雅低额溞的生殖与发育，动物学报,42(3): 287-296，19962 N. N. Khmeleva, A. P. Golubev, A. Kidava, Growth andreproduction of Daphnia magna under changingphotoperi

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