.EMTandcancerstemcells初稿

1、第十一章 恶性肿瘤上皮间质转化与肿瘤干细胞王冠军李薇第一节 根本概念 1.上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)：是指上皮细胞去除已分化表型如上皮性钙粘蛋白：E-cadherin，包括细胞-细胞间粘附、顶底极性、运动能力低等特性，而获得了某些间充质细胞的表型如纤维粘连蛋白：fibronectin，包括移动、侵袭、抗凋亡等特性。EMT被认为是肿瘤转移过程中出现的重要演变。2.间充质上皮转化mesenchymal-epithelial-transition，MET: 肿瘤上皮细胞获得EMT后进入微血管和/或淋巴管，在循环中经过间质-上皮转变(ME

2、T)，成为增殖能力强的上皮细胞。 3.肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)学说：肿瘤组织或者肿瘤转移灶中存在极少的且具有无限自我更新能力并可导致肿瘤发生的细胞肿瘤干细胞，CSCs与肿瘤发生、复发和转移的密切相关。第二节：上皮间质转化与肿瘤干细胞与恶性肿瘤生物学行为 1 上皮间质转化EMT与肿瘤恶性生物学行为1.1 上皮间质转化EMT的分子标志EMT过程是细胞丧失上皮相关标志，转而表达间质细胞表型，并获得侵袭转移能力的特征。EMT过程中上皮相关分子标志丧失表现为：维持上皮细胞极性及细胞间粘附相关蛋白表达降低，如E-cadherin、RhoA及Plakophilin 2等；局部上

3、皮细胞间粘附蛋白存在异常定位，如-catenin，正常情况位于细胞膜，而在EMT时却定位于细胞浆；细胞经历EMT时上皮细胞角蛋白cytokeratins表达下降，如cytokeratin-8与cytokeratin-18。EMT过程中细胞迁移及浸润有关基因表达增强，如波形蛋白Vimentin在EMT时过表达，Vimentin是Invadopodia成熟的先决条件，而后者是细胞浸润必不可少的。在EMT过程中，与肿瘤细胞侵袭相关的转录因子，如Notch1、Slug、Snail及Twist异常表达，导致肿瘤细胞的侵袭性增强。表1列出EMT中局部异常表达的分子标志。表1 EMT异常表达的分子标志标志功

4、能分布组织EMT下调分子标志-catenin细胞粘附分子肺-catenin细胞膜细胞粘附分子结肠、胰腺NETClaudin细胞粘附分子食管、乳腺Cytokeratins角蛋白肺、食管E-cadherin细胞粘附分子结肠、乳腺、肺、卵巢、食管等Occludin细胞粘附分子卵巢EMT上调分子标志Brachyury转录因子前列腺、乳腺、肺b-catenin胞浆/细胞核转录因子乳腺、宫颈EGFR酪氨酸激酶受体宫颈N-cadherin细胞粘附分子卵巢、前列腺Notch-1转录因子前列腺p16INK4a细胞周期调控因子结肠、移形上皮Slug转录因子乳腺、卵巢Snail转录因子乳腺、宫颈、卵巢TTF-1转录

5、因子肺Twist转录因子乳腺、胃Vimentin细胞骨架细丝乳腺、食管、宫颈ZEB1转录因子结肠、乳腺、卵巢1.2 上皮间质转化EMT在恶性肿瘤浸润、转移中的作用及与肿瘤患者预后的关系EMT最重要的临床意义是其与肿瘤浸润及转移有关。首先，侵袭性强的肿瘤细胞通常呈EMT样表型，如伴有E-cadherin表达缺失或突变，表达Vimentin；前列腺癌发生骨转移灶细胞Notch-1水平明显高于原发灶。其次，EMT使肿瘤细胞获得了更强的侵袭性，如低氧通过诱导Slug及Snail表达上调，增强了乳腺癌细胞迁移及浸润能力；Snail通过诱导EMT加速恶性黑色素瘤细胞的转移及扩散。由于在大多数组织病理标本中

6、，肿瘤为多细胞转移，而间充质样肿瘤细胞少见，需要进一步确定EMT在转移中的作用。大量临床研究证实了EMT与肿瘤患者预后密切相关：前列腺癌根治术后，EMT相关分子的表达是其生化复发的独立预后因素；三阴性乳腺癌患者Vimentin高表达与不良预后有关。但仍然有一定争议，lee等发现EMT分子标志与乳腺癌患者无病生存率及总生存率均无关，提示EMT可能在不同类型、不同分期的预后作用可能不同。另外，由于肿瘤标本中不同区域肿瘤细胞的异质性存在，因此手术标本EMT相关分子标志表达情况尚不能代表肿瘤整体情况。而且，由于尚缺乏统一的EMT评价标准，在不同研究中，定义为EMT的基因类型及数量均不尽相同，从而降低了

7、这些研究的可比性。2. 调控上皮间质转化EMT的信号转导通路EMT受细胞内信号转导系统的精确调控：细胞外信号与细胞外表特异性受体结合进入细胞内，通过转化生长因子(TGF-)、Wnt、Notch、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，P13K)、Hedgehog、NF-B等信号途径活化核内转录因子，最终改变肿瘤上皮细胞表型。此外，一些转录因子及microRNA也参与调控EMT过程如以下图。引自。艳萍，把引入文献加上2.1 EMT相关信号通路TGF-信号转导通路TGF-通过磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成三聚体后进入细胞核，进一步与DNA结合

8、转录因子结合激活下游核转录因子，导致E-cadherin下调，Vimentin及N-cadherin等表达上调，使上皮来源的肿瘤细胞发生EMT。Wnt信号转导通路经典Wnt通路由细胞外的Wnt蛋白、膜受体卷曲蛋白、胞质内的-catenin以及下游的靶基因组成。通过胞质内-catenin的累积，转位入细胞核，从而激活下游相关靶基因，促进肿瘤EMT及肿瘤发生侵袭转移。因此，Wnt-catenin信号转导通路的核心机制是-catenin稳定性的调节。-catenin过度活化或者失调均可诱导EMT的形成。Notch信号转导通路Notch信号通路是肿瘤形成的重要的信号转导途径。上皮细胞内Notch信号激

9、活后，通过抑制E-cadherin及-catenin 表达，上调Vimentin及纤维连接蛋白，并促进肿瘤上皮细胞形态、功能等向间充质细胞方向转化。与EMT相关的信号通路还包括Hedgehog、NF-KB及MAPK等信号通路。随着对EMT发生机制的深入研究，尤其对调控EMT的相关细胞因子、信号通路之间的交互作用的深入了解，有助于发现调控EMT的驱动基因，为靶向EMT治疗提供重要理论依据。2.2 转录因子及microRNA除上述调控EMT的重要信号通路外，参与胚胎发育和肿瘤进展中许多转录因子也能促进EMT发生，包括抑制E-cadherin表达的Snail1、Slug、SIP2ZEB2、E47，以

10、及很少直接作用在E-cadherin上的转录因子Twist1、FOXC1、FOXC2、GSC、ZEB1等。这些转录因子相互作用，共同形成网络信号启动并维持EMT，这些转录因子同时促进上皮细胞具有干细胞特性。非编码RNA在调节基因和蛋白水平表达中也具有重要作用，并成为EMT和肿瘤干细胞的枢纽调控分子。研究发现miR-200家族miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141与miR-429和miR-205家族，通过调控Twist、Snail、ZEB1 和ZEB2 等EMT 相关的转录因子，激活EMT过程，并保持干性。3 肿瘤微环境在上皮间质转化EMT中的作用在肿瘤的发生、开展

11、及转移过程中，肿瘤细胞与其所处的通过微环境通过直接或间接作用，导致其形态结构和分化状态处于可调控的动态变化中：肿瘤上皮细胞可转化为具有浸润转移能力的间质样细胞EMT，而在适宜的微环境中，间质样细胞也可反向分化为肿瘤性上皮，形成转移灶MET。微环境通过如下方面调节肿瘤EMT和MET过程：3.1 缺氧微环境随着肿瘤组织的增大逐渐产生缺氧，缺氧的关键调节因子缺氧诱导因子HIF-1通过直接或者间接激活调控EMT的重要信号转导通路如TGF-、Notch、NF-KB、Wnt、P13K信号通路等或者关键的转录因子如Twistl、Snml、Slug、ZEBl、ZEB2和E12/E47促进EMT。目前在多种上皮

12、源性肿瘤，包括乳腺癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌和结肠癌等均证实了缺氧可以诱导EMT发生。3.2 肿瘤基质肿瘤基质细胞通过分泌多种生长因子和/或者细胞因子以旁分泌途径促进EMT，导致肿瘤细胞恶性转化，这些生长因子和/或细胞因子包括TGF-、表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、肝细胞生长因子(hepatoeyte growth factor，HGF)、基质蛋白酶等。有研究发现肿瘤相关的成纤维细胞tumor-associated fibroblast，TAF可能来源于

13、肿瘤上皮细胞，通过TGF-信号通路下调E-cadherin表达，发生EMT。第三节 肿瘤干细胞CSCs、上皮间质转化EMT及间充质上皮转化MET在肿瘤转移及耐药的作用3.1 肿瘤干细胞CSCs学说：细胞外表标志及起源肿瘤干细胞Cancer stem cells,CSCs是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞，同时具有自我更新能力及多向分化潜能。CSCs的概念在1994年由Lapidot首次提出，发现CD34+/CD38-的急性髓系白血病细胞具有干性。此后，在乳腺癌、脑胶质瘤、大肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌及黑色素瘤等均证实了CSCs的存在。尽管CD44、CD24、CD29、CD34、CD90、CD1

14、33、上皮特异抗原ESA、乙醛脱氢酶1ALDH1等用于别离、鉴定和扩增不同类型的CSCs，然而，不同类型肿瘤的CSCs细胞外表标志不同，目前对于鉴定不同类型肿瘤的CSCs的特异性细胞外表标志仍处于研究阶段。CSCs具有肿瘤源性，关于其来源尚无定论，目前有2种假说：1. CSCs来源于正常的干、祖细胞：由于其所处微环境发生变化或者各种原因所致基因突变使正常干、祖细胞演变为CSCs，支持该假说的证据包括CSCs在细胞特性、免疫表型、功能及外表标志方面与正常干、祖细胞类似。2. CSCs来源于正常的体细胞：正常的体细胞发生基因突变或者微环境变化时获得了干细胞样特性及肿瘤恶性生物学行为，如人类乳腺癌细

15、胞发生EMT，并具有干性。3.2 EMT及MET在肿瘤干细胞转移及耐药中的作用肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多途径，涉及多基因变化的“侵袭转移级联反响过程，包括肿瘤细胞在原发灶脱落，通过血管内渗(intravasation)进入血液循环、在血液循环中存活下来的肿瘤细胞通过血管外渗(extravasation)进入转移的组织器官，形成微小转移灶，并在局部克隆性生长，最终形成转移瘤。CSCs在这一系列的转移过程起着非常重要作用。已有研究证实，CSCs发生EMT后成为肿瘤转移干细胞metastatic cancer stem cell，MCSC而转移至远处靶器官。越来越多的根底研究和临床证据提示CS

16、Cs可能是肿瘤发生转移、耐药及复发的根源。Mani首次发现了在乳腺癌CSCs和EMT之间的联系：EMT诱导因子TGF-使乳腺癌上皮细胞EMT后导致其向干细胞表型转化，转化后的细胞具有更强的肿瘤源性；此外，在乳腺癌原发部位别离出的CSCs也高表达Twist、Snail及Vimentin 等EMT相关的分子。有趣的是，经过EMT发生远处转移的肿瘤细胞需要重新获得上皮细胞特征才能最终形成转移瘤，从而提出了MET间充质上皮转化的概念。为什么CSCs在转移过程中需要MET和MET交替呢？目前的研究证实，EMT使肿瘤细胞获得干性和极性，但失去了增殖能力，而在肿瘤转移病灶中发生MET使间充质样的细胞回到分化

17、程度更高的上皮细胞状态，并具有旺盛的增殖活性，MET最终使肿瘤细胞克隆性生长、定植组织器官而产生转移瘤。由于目前的化疗药物主要针对处于增殖周期的“活泼肿瘤细胞，而发生EMT的CSCs多处于G0 期，导致对细胞周期特异性化疗药物耐药，通过敲除Twist或Snail等EMT相关基因，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，也证实了EMT在肿瘤耐药中的作用。其次，CSCs 具有强大的DNA修复活性，使其在自我更新和增殖的过程中对放化疗产生耐药，并可传递给其子代细胞，从而具有更强的耐药性。此外，肿瘤干细胞膜外表高表达多种耐药相关蛋白如ABC转运蛋白，也是介导肿瘤耐药性产生的重要原因。肿瘤干细胞理论很好解释了肿

18、瘤转移及耐药的发生，通过寻找CSCs外表特异性分子标志，深入研究EMT和MET的调控机制，靶向调控CSCs的EMT和MET的关键信号通路可能为肿瘤的治疗提供了更有效的方式，并有望到达治愈肿瘤的最终目标。第四节 结语与展望 尽管目前的治疗策略可使肿瘤在近期内缩小或移除，仍有一局部患者因肿瘤转移死亡。此外，肿瘤多药耐药是导致化疗失败的重要原因。肿瘤干细胞与肿瘤的转移及耐药的发生密切相关，因此，通过铲除肿瘤干细胞有望治愈肿瘤。由于肿瘤干细胞出现EMT是肿瘤侵袭、转移和耐药发生的重要特征，通过阻断EMT和MET可能抑制肿瘤干细胞。因此，建立有效的抗肿瘤干细胞的治疗方案，杀死肿瘤干细胞，已经成为肿瘤研究中的重大课题。目前，针对肿瘤干细胞的治疗可能有以下策略：1. 杀灭或者抑制肿瘤干细胞：通过制备针对造血干细胞的单克隆抗体，同时可在抗体上螯合化疗药物或放射性物质，使之能够特异性杀灭肿瘤干细胞。实现这一方案需要寻找肿瘤干细胞的特异性标记物，才能识别肿