基因工程原理18日新来的--01244

1、12基因工程原理一 012444 月 21 日 14:30 17:00一、名词解释1. 基因：是 DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小 功能单位。2. 基因工程：是指利用重组技术，在体外通过人丁“剪切”和“拼接”等方法， 对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导人微生物或真核细胞内 进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改 造、创造新的生物类型。3. 顺反子：基因作为一个遗传功能单位，它所对应的一段核苷酸序列被称为顺反 子。一个顺反子编码一条完整的多肽链，因此，顺反子是一个功能单位。4. 启动子：是位于基冈 5端上游紧靠转录起

2、点的一段非编码序列，其功能是引 导 RNA 聚合酶与基陶相应部位的正确结合，启动基的转录。5. 外显子与内含子：被分隔开的编码序列称为外显子，是在基因内编码蛋白质的DNA 片断；在编码序列之间的序列称为内含子，是在基因内不编码蛋白质的DNA片断。6 操纵子：原核生物中，功能相关的基因常串联在一起，构成信息区，与其上游 的调控序列共同组成一个转录单位一一操纵子。7. 增强子：增强子是一段 DNA 序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合 的顺式作用元件。反式作州因子与这些元件结合后能够，调控（通常为增强）邻近基田的转录。8. 基因组：在特定的细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和称为

3、基 因组。9. 信号肽：约南 15 -30 个疏水氨基酸残基组成，其特点为疏水性。它的作用是使 蛋白质从内质网膜进入高尔基体。10. 聚合酶链式反应：是指在引物存在的条件下、 以 DNA 为模板、南 DNA 聚合酶催 化的对特定基因或 DNA 序列进行体外快速扩增的反应，故又称为基因的体外扩增法。11. 双链 DNA 的熔解温度：加热可以打开 DNA 双链结构，当一半分子为单链而另外一半分子仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA 的熔解温度，即几12. 核酸分子探针：是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列邀火杂交，蹦此 可以刚于待测核酸样品巾特定基因顺序的探测。13. 膜上印迹杂交：是指将待

4、测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相巾标记的核酸探针进行杂交的过程，也称印迹技术（或方法） 。14. 核酸酶：是一类能够水解相邻两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，使核酸分子断裂的一种酶。15. 黏性末端：DNA 两条链上的断裂位置不在同一碱基对处，而是交错地切开，这 样会形成黏性末端。16. 同裂酶：来源不同，但识别的是相同的核苷酸靶序列，切割 DNA 链后可以形成相同末端的一类酶则称为同裂酶（也称同功异源酶）。17. 质粒：是存在于细胞质巾的一类独立于染色体外的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状 DNA（cccDNA）少数是线性。18. 溶菌周期：噬菌体吸附到寄

5、主细胞表面之后，注入DNA 噬菌体的 DNAt行复制及蛋白质的合成，并组装成噬菌体颗粒，最后使寄主细胞裂解，释放出子代噬菌体颗粒。19. COS 位点：入噬菌体 DNA 是一条线性双链 DNA 分子，长度为 485021）p。在其两端的 5 /末端各带有一个长为 12 个碱基的单链互补黏性末端。一旦进入宿主细胞， 黏性末端互补配对形成双链环状DNA 这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos 位点20. 转染：重组体 DNA 分子直接感染大肠杆菌， 使之侵入寄主细胞内。这种南寄主 细胞捕获噬菌体（病毒）DNA 勺过程为转染。21. 穿梭载体：是指可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体，含有不

6、止一-个 ori、能携带插人序列在不同种类宿主中繁殖，在原核生物和真核生物细胞中都能复制和表达。22. 目的基因：基因丁程主要是通过人丁的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已 被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段称为目的基因。23. 基因组文库：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌 的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库。24. CDNA 文库：以 mRNA 为模板，在体外经逆转录酶催化反转录生成 cDNA 与适当 载体连接后转化受体菌并繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA 言

7、息的 cDNA 克隆 集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。25. 定点诱变：取代、捅入或缺失克隆基因或 DNA 序列中的任何一个特定的碱基， 这种体外特异性改变某个碱基的技术叫作定点诱变。26. 感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、 CaCL、RhCI 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。27. 核糖体结合位点：是指紧靠启动子下游，从转录起始位点开始延伸几十个碱基长度的一段序列，翻译起始密码子 AUG 通常位于它的巾心位置，是核糖体 RNA 识 別与结合的位点，在原核生物巾义被称为 SD 序列。28. 密码子偏好：

8、通过对大肠杆菌各种序列的大量分析表明， 同义密码子在基因中；H 现的频率并不一样，即存在密码子使用差异的现象，这种现象同样存在于真核 生物中，称为密码子偏好或密码子偏爱。29. 融合蛋白：将外源蛋白基与受体菌自身蛋白基冈重组在一起，但不改变两个基因阅读框，这样形成的蛋白质称为融合蛋白。30. 基因工程菌：含有表达型重组 DNA 的生物细胞（或细菌），能够通过工程方法 在体外进行规模化培养，获得大量的外源基因的表达产物，这种用途的生物细胞 常称为基因丁程细胞（或基因丁程菌）。31. 重组蛋白的复性：是指在适当的条件下使伸展的无规则的变性重组蛋白质重新 折叠形成可溶的具有生物活性的蛋白质。32.

9、分泌信号序列：也称信号序列，编码前体蛋白上 N 端一段 17-30 个氨基酸残基 的分泌信号肽。作用是引导分泌蛋白在细胞内沿着正确的途径转移到胞外。33. 前导序列：在原核生物中，一条瑚 RNA 分子常常编码数种不同的多肽链。这种多顺反子 mRNA 勺头一条多肽链合成的起点， 同 RNA 分子的 5Z-P 末端问的距离可达数百个核苷酸.这段编码区之前的不转录的mRNK段，叫做前导序列。34.假病毒：逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白（Env）决定，Env 来自何种病毒，包装出的逆转录病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。35. 磷酸钙转染法：是把含外源基因的质粒或已克隆化的基因作为转染物，与磷

10、酸钙转染液混合，加入到宿主细胞的培养环境中，在磷酸钙转染液的媒介下能使转染的 DNA 被整合到受体细胞的基因组组中。36. HAT 选择法：由于选择 tk+细胞的培养基含有次黄嘌吟、氨基喋昤和胸苷，所 以叫做 HAT 选择法。37. 转基因动物技术：是以动物个体作为基因受体的基因表达技术。所有转基因动物都是南于外源基闲（包括同一物种的DNA 导人动物的基出组而产生了可以遗传的改变。38. 基因座控制区：是染色体 DNA 上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作 用因子的结合序列，可能参与蛋白质刚子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。它具有使整合到宿主染色体上的外源基因不依赖其在基因组的位置

11、而正确表 达的功能。39. 植物基因工程：又称转基因或植物遗传转化，其研究的关键是从不同生物中提 取外源基因片段与载体 DNA 连接并导入植物细胞，使其在植物细胞内进行复制和 表达，以达到改3变受体植物细胞遗传特性，培育优质高产抗逆作物新品种等日的。40. 种质受体系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞或种子为受体细胞进行基 因转化的系统称为种质受体系统。41. 直接分化芽：是指外植体细胞不经过愈伤组织阶段而以组织培养直接分化形成 不定芽。42. 共整合载体：一元载体是巾间表达载体和改造后的卸甲Ti 质粒之间同源重组产生的一种复合型载体，通常也称为共整合载体。43. 基因诊断：是基于基因与疾病

12、的相互关系，利用现代生物学和分子遗传学的技 术方法，直接从 DNA 水平上来探测基因的存在，分析基因的类型缺陷及其表达功 能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。44. DNA 多态性：遗传连锁分析生物个体间 DNA 的序列存在差异，据估计每 100 - 200 个核苷酸中便有 1 个发生突变，这种现象称为 DNA 多态性。45. 基因分离：是指利用 DNA 重组技术克隆、鉴定、扩增、纯化用于治疗的基因， 并根据病变基因的定位，与特异性整合序列（即同源序列）和基因表达调控元件 进行体外重组操作46. 基因工程疫苗：就是用基阂工程方法或分子克隆技术，分离出病原的保护性抗 原基阅，将其转成为不带毒

13、力相关基因的基出缺欠苗。成为不带毒力相关基因的 基因缺欠苗。47. 基因工程抗体：是利用抗体工程技术在基因水平上对抗体分子进行重组和改 造，并导人原核、真核、酵母或重组病毒等表达系统进行表达、生产的抗体。48. 转基因食品：是指用转基因生物所制造或生产的食品、食品原料及食品添加物 等。49. 序列比对：是将两条或多条序列位点上的匹配位点（相同或相似残基）与不匹 配位点（不相似的残基）按照一定的记分规则转化成序列问相似性或差异性的数 值来进行比较。50.SD 序列：原核生物 mRNA 勺起始密码子 ATC 的上游 3 -10 碱基处有一个核糖体 结合位点，根据发现者的名字命名为 Shine -

14、Dalgarno 序列， 简称 SD 序列。二、应掌握的知识点1.生物学家 Schleitlen 和 Schwann 经过多年的研究观察，提出了细胞学说，认为 所有生命组织的基本组成单位是形态相似分化不同的细胞，从而将宏观的生命现带人微观世界。2. 遗传学家孟德尔经过多年的豌豆杂交实验，提出遗传因子是主宰生命遗传现象 的基础。3. Morgan 等人经过多年的果蝇杂交研究，将基因与生物体中某一特定的染色体联 系起来，从而进一步完善和发展了遗传规律，提出了基阂学说，并特别指出基阂 是组成物种的独立要素。4. 最早用实验证明基闪化学本质的是微生物学家0.Avery。他所进行的肺炎球菌的转化实验，在

15、理论上确立了 DNA 分子就是遗传信息及基出的载体。5. J . Watson 和 r Crick 于 1953 年揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型。6. 基因工程技术之所以能够在体外将不同来源的DNA1新组合构成新的 DNA 分子，并在宿主细胞扩增和表达，主要依赖一系列重要的克隆丁具，主要包括：基因丁 程载体、基因工程的丁具酶及基因工程的受体系统。7. 有关基因工程受体系统，目前最为常用的受体系统是大肠杆菌受体系统和酵母 受体系统，它们分别是原核与真核受体的代表。8.W11tson 和 Crick 提出的 DNA 分子双螺旋结构模型为遗传信息传递提供了物质 结构基础。根据这个模型，DN

16、A 分子是由 2 条互补的多核甘酸链相互缠绕而成， 2 条链之间通过碱基配对结合在一起。9. 原核基因与真核基凶组成大体相似，它们都开始于启动子，终止于终止子。但 是真核基因结构更复杂一些，其内部往往是不连续的，外显子常被内含子中断。10. 外显子和内含子构成结构基因，在转录时被一起转录下来，内含子随后被切除。 内含子并不是一些无用的序列，其中含有许多调控信息，甚至含有增强子。11. 内含子和外显子的划分不是绝对的， 在选择剪接时，有些内含子会有一部分保留在成熟的 mR-NA 中，这种情况下，这一部分内含子就成了外显子。12. 真核基因外显子与内含子以外的部分， 包括启动子、上游启动子元件、增

17、强子、加尾信号和一反应元件等，它们被统称为顺式调控元件或称顺式作州元件。13. 原核生物的转位因子可以分成三种不同的类型：分子量小于2000hp 的叫做插入序列，大于 20001）1）的称为转座子，而噬菌体 Mu 和 D108 则属于第三种类型的 转位闪子，即可转座的噬菌体。14. 转座（位）作用的机制有 2 种，即：简单转座（又称单纯转座）和复制性转座。15. 将假基闪与真基出的结构比较，假基有 5 个特点：（1）没有内含子；（2）具有 与 mRNA 勺 poly （A）尾的相应结构；（3）两侧有顺向重复序列； 随机出现在非 正常的位置上；（5）广泛突变。16. 病毒基因组的 DNA 或 R

18、NA 可能是单链，也可能是双链；可能是闭合环状分子，也可能是线性分子。如乳头瘤病毒基因组为闭环双链DNA 腺病毒基因组为线性双链 DNA 噬菌体 M13 基因组为单链环状 DNA（其复制型为双链环状 DNA，脊髓 灰质炎病毒基因组为单链 RNA 呼肠孤病毒基因组为双链 RNA17. 线粒体是真核细胞的一种细胞器，其中含有线粒体DNJL 分子，构成自己的基因组，编码细胞器的一些蛋白质。18. 除了少数低等真核生物的线粒体基因组是线状DNA 分子外，一般都是一个环状DNA 分子。由于一个细胞里有许多个线粒体，而且一个线粒体里也有几份基因组 拷贝，所以一个细胞里也就有许多个线粒体基因组。19. 不同

19、物种的线粒体基因组的大小相差悬殊。已知的是哺乳动物的线粒体基因组 最小，果蝇和蛙的稍大，酵母的更大，而植物的线粒体基因组最大。20. 反向重复序列有两种形式，一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔 序列；另一种形式是两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列，这种结构亦 称回文结构。21. 时间特异性是指某一基因的表达遵循特定的时间顺序，按功能需要表达。基因表达的时空特异性本质上是与基因表达方式密切相关的。22. 看家基的表达属于基础或组成性表达；可诱导（或阻遏）基因，其表达受诱 导剂（或阻遏可诱导（或阻遏）基因。23. 原核生物和真核生物的基表达调控在细节上差异很大，但两者的调控模式及测

20、控原理极为相似。调节作用主要包括核酸分子之间的相互作用、核酸与蛋白质 之间的相互作用以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。24. 调控作用可能是正向的或负向的，调控点可以位于基因的表达过程的各个环节，如基因的激活、转录起始、转录后加工、mRNAI 解、蛋白质翻译、翻译后加.丁 和蛋白质降解等。25. 与真核基因表达调控相比，原核基因表达调控有自己的特点： 普遍存在操纵子 调控模式；通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录； 转录与翻译的偶联， 使基因调控成为快速有效的调控方式。26. 原核生物中，基因转录水平的调控主要是操纵子的调控模式，并以转录起始的调节为主，但同时也在其他形式的调控方式，如转

21、录终止（色氨酸操纵子的转录 衰减调控）和基因重组（沙门菌基因重组调控）的调节方式。27. 翻译水平的调控是原核生物基因表达调控中除转录以外的另一个重要层次，其调节作用包括以下几个方面：（1） SD 序列对翻译的影响；（2） mRNA 勺稳定性；（3） 翻译产物对翻译的影响。28. 真核生物的基因表达调控可以在多个水平上进行，包括：DNA 水平的调控、转录水平的调控、转录后水平调控、翻译水平的调控、翻译后水平的调控。29. 真核生物基因表达在 DNA 水平的调控主要方式包括：染色质结构对基因表达的 调控作用、基因修饰、基因重排、基因扩增。30. 共价修饰有两种常见的方式：磷酸化一去磷酸化，糖基化

22、。31. 真核生物 mRNA 勺初级转录产物经过加帽反应，在5,端形成一个特殊结构，7-甲基鸟苷三磷酸。32. 真核生物除组蛋白基阅编码产生的 m RNA 外,其他结构基阅编码产生的 mRNA3端都有 50 -1 50 个腺甘酸组成的多聚腺甘酸尾，即poly （A）尾。它是在转录后加上去的，称为加尾。33. mRNA 羽译的产物一一新生多肽链大多数是没有生物学活性的，必须经过加工、 修饰才能成为有活性的蛋白质。加工、修饰过程包括信号肽的切除、多肽的修饰 和剪接，这些均属翻译后水平的涮控。34. 新生肽链的修饰是测节蛋白质活性的重要方式，其主要的修饰方式有磷酸化、 羟基化、糖基化、乙酰化等。35

23、. 真核生物 95%勺 DNA 主要存在于细胞核内，其.余 5%为细胞器 DNA 存在于线 粒体和叶绿体中。436. RNA 分子约有75clo 存在于胞浆中，另有 10%在细胞核内，15%在细胞器中。37. RNA 以 rRNA 所占比例最大（80% - 850/0 ），tRNA 及核内小分子 RNA 占 10r70 - 15clo，而 mRNA 分子只占 Iqo -5%。38. 为了保持核酸的完整性，在提取过程中要注意防止核酸酶对核酸的降解，防止化学因素（酸碱等）和物理因素（高温或机械剪切等）引起核酸变性或破坏。39. 制备 RNA 要特别注意防止核酸酶的作用，因为核酸酶分布很广，活力很高

24、；而对 DNA 更重要的是防止张力剪切作用，因为DNA 分子特别长，容易断裂。40. 细胞的破碎有多种方法，包括物理方法、化学方法、酶法等。常用的物理方法有超声波法、匀浆法、液氮破碎法、AI203粉研磨法等。41. 质粒 DNA 分离方法有碱裂解法、煮沸法、去污剂仃 riton/SDS）裂解法、CsCI -EB （氯化铯一溴化乙啶）密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法及商业化的试剂盒等。42. 质粒的大量制备可采用微量制备的方法提取后.再采用聚乙二醇沉淀等方法纯化。43. 所有 RNA 的提取过程巾都有五个关键：（1）样品细胞或组织的有效破碎；（2）有效地使核蛋白复合体变性

25、解离，释放；H P,.NA ； （3）对 RNA 酶的有效抑制；（4）有效地将 RNA 从 DNA 和蛋白质混合物中分离；（5）对于多糖含量高的样品还要采取 措施有效去除多糖杂质。其中最关键的是抑制 RNA 酶的活性。44. 紫外光谱分析法的原理基于 DNA 或 RNA）分子在 260nm 处有特异的紫外吸收峰 且吸收强度与系统中 DNA 或 RNA 勺浓度成正比。45. 在波长 260nm 紫外线下，10D 值的光密度相当于双链 DNA 浓度为 50pgg/mL; 单链 DNA 或 RNA 为 40gg/mL;单链寡核甘酸为 20 口 g/n）L。46. 可通过测定在 260nm 和 280

26、1m 的紫外吸收值的比值（A260/A280）来估计核酸的 纯度。对 DNA 而言其值大约为 1.8，高于 1.8 则可能有 RNA 污染，低于 1.8 则有 蛋白质污染。也可能，出现既含蛋向质又含 RNA 勺 DNA 溶液比值为 1.8 的情况。47. 琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：（l）形成的凝胶具有大量微孑 L,其孑 L 径尺寸取决于它的浓度；（2）透明，无紫外吸收；（3）无毒，热熔冷凝，制胶方便；（4）热可逆性，具有一定强度。48. 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA 也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的 DNA 分子。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为 线

27、状分子，最慢的为开环状分子。49. 水平式琼脂糖凝胶电泳的操作并不复杂也不闲难，但影响 DNA 分子在电泳中迁移速率的因素是多方而的，除了取决于DNA 分子大小与构象外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压、缓冲液 pH 值和电泳时的温度等。50. 现在，PCF 技术不仅可以刚来扩增与分离日的基冈，而且存临床医疗诊断、胎 儿性別鉴定、癌症治疗的监控、基突变与检测、分子进化研究，以及法医学等 诸多领域都有着重要应用。51. PCR 反应的最后结果是，经 n 次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA 分 子数，即两条引物结合位点之间的 DNA 区段的拷贝数，理论上的最高直应是 2”。52. PCR 反应

28、涉及多次重复进行的温度循环周期，而每一个温度循环周期均是由高 温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤组成。53. Taq DNA 聚合酶对金属离子的性质和浓度较敏感，特别是镁离子。由于脱氧核苷三磷酸可结合镁离子，因此作为激活剂镁离子的精确浓度便主要取决于dNTP 的浓度。54. PCRT增时，是从引物的 3。端开始按照 5 / 3。，的方向延伸。因此，引物 3/端的碱基必须与模板的碱基互补，才能有效的延伸；相反，对其5。端的要求就较低。有时可以在引物的 5 端加上特殊的序列。55. 引物与模板退火的温度和所需的间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。56. 不对称 PCR 技术简化了细菌

29、培养及 DNA 分离纯化等步骤，可直接用单菌落或噬 菌斑抄“增单链模板 DNA 阂而比双链 DNA 更适用于 Sanger 法测序。57. 一般来说，在核酸分子杂交中究竟选择哪一种滤膜，是南核酸的特性、分子大 小、在杂交过程中所涉及步骤的多寡以及敏感性等参数决定的。58. 非放射性标记物的体外标记常用酶法，先用生物素、地高辛、荧光素等标记物 标记核苷酸，然后再通过酶促反应按切口平移法、随机引物法或末端标记法制备 成 DNA RNA 或寡核芹酸探针。59. 目前最常用的几种岡相支持物有：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜、滤 纸等。60. 硝酸纤维素（滤膜）优点：结合 ssDNA, RNA 和蛋

30、白质的能力为 80 - 100gg/cm2,价格低廉，可用于微量制备。缺点：易碎、易皱缩；不能与DNA 共价结合，此重复使用能力有限；在 10 x SSC 缓冲液巾结合能力下降；要用特殊的程序才 能结合 RNA 或小片段 DNA61. DTA 制剂中的其它杂质，如蛋白质、酚、氯仿、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。62. 大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37C，但也有许多例外的情况。消化反应的温度低或高于最适宜温度都会影响限制性核酸内切酶的活性。63. 某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA 所需要的酶量要比消

31、化线性的DNA 高出许多倍，最高的可达 20 倍。还有一些限制性核酸内切酶切割位于DNA 不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。64. 在基因丁，程中常用到的 DNA 连接酶主要是 E coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连 接酶。65. 基因工程中应用较多的 DNA 修饰性酶类有：末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移 酶）、T4 多核苷酸激酶和碱性磷限附。66. 用酿酒酵母做宿主表达的乙型肝炎疫苗、人胰岛素和人粒细胞集落刺激因子等 基因工程产品均已正式上市。67. 酵母的载体与宿主染色体间发生同源重组的过程主要有两种形式：单交换整合与双交换整合。68. 转化酵母的常见方法有 4 种：原生

32、质球法、电击转化法、PEG 方法和 Li+盐转化方法。筛选方法主要是：营养缺陷型筛选和抗生素抗性筛选。69. 在进行酵母转化时，主要采用电击转化法和Li+盐转化方法，但电击转化法的转化效率明显高于 Li+盐转化方法。70. 克隆载体目前主要有质粒载体、噬菌体载体、酵母载体、人丁染色体载体等。71. 存琼脂糖凝胶电泳巾，不同构型的同一种质粒DNA 尽管分子量相同，由于插入的溴化乙啶（EB）量不同，因而具有不同的电泳迁移率，其中SCDNA 勺泳动速度最快，OC DNA 泳动速度最慢，L DNA 居中。72. 严紧型质粒是-一种低拷贝数的质粒，只在细胞周期的一定阶段进行复制，与 染色体复制同步，当染

33、色体不复制时，也不能复制。在宿主细胞中拷贝数较少， 大约 1 至数个。如F 因子。73. 松弛型质粒是一种咼拷贝数质粒，在整个细胞周期巾随时都可以复制，是独立 于染色体外进行复制的。在宿主细胞巾有许多拷贝，一般存 10 个以上，甚至多达 数百个。如 ColEI质粒。74. 在基因丁程中，松弛型质粒更适合构建克隆载体。因为使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可 111 原来 20 多个扩增 至 1000 - 3000 个，此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可南原来的 2%增加至 40%-5

34、0%.75. 质粒克隆载体经历了 3 个发展阶段，在 pBR322 出现之前，pSCIOI 和 ColEI 应 用较多；pBR322 出现之后，通过调整载体的结构，提高载体的转化效率，建立了 pUC 系列载体；随后，又进一步完善了载体的功能，形成了表达载体和穿梭载体5等功能性载体。76. 噬菌体颗粒的外壳是蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线形DNA 还有双链环形 DNA 单链环形 DNA 以及单链 RNA 等多种形式。77. 不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大， 可分为 3 种类型。大多数噬菌体是具尾部结构的二十面体，头部下端连接着一条尾部结构，看起来像是一种小型的皮下注射器，如 T4 噬菌

35、体。另两种类型是无尾部结构的二十面体型和线状体型。78. 入 DNA 至少包括 61 个基因，其中有一半左右参与了噬菌体周期活动，这类基 因称为入噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影 响噬菌体的生命，这类基因称非必要基因。取代了非必要基因的外源基因可以随 寄主细胞一起修复和增殖，这一点在基因，下程中是非常重要的。79. 野生型的入噬菌体并不适于直接用作基因克隆的载体，一方面入 DNAS因组大而且复杂，特别是其中具有多个基因克隆常用的限制酶识别位点（如5 个 BamHI位点、6 个 Bgl II 位点和 5 个 EcoRI 位点等）；另一方面入噬菌体外壳只能接纳 相当于

36、基因组大小的 75% - 105%的 DNA 分子。80. 从本质上看，入 DNA 勺转染作用同质粒 DNA 的转化作用并无原则上的差别，但 一般情况下，转化得到的是转化子菌落，转染得到的是噬菌斑。相对转化作用，转染是一个低效的过程，很难满足一般的实验要求。所以在基因操作中，入重组体 DNA 的直接转染并不常用。81. 目前主要应用体外包装技术， 将入重组体 DNA 包装进噬菌体颗粒，再转导受体细胞，这样便提高了外源 DNA 片段导入细胞的效率。82. 由于入噬菌体对所包装的 DNJL 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可 插入 6kb 外源 DTA 片段，最大 llkb。83. 一般情况

37、下，置换型载体克隆外源片段的大小为9 -23kb，常用来构建基闲组义库。84. 来自入 DNA 部分的片段除了提供 COS 位点，在 cos 位点两侧还具有与噬菌体包 装有关的 DINA 短序列，这样就能够包装成有感染性的噬菌体颗粒。85. 2gm 质粒，闭合环状双链 DNA 分子，长度为 2gm,分子大小约为 63001）l）， 通常与蛋白质结合构成复合物。含有自主复制起始区（Ori）和 STB 区，在选择标 记上，一般是利川酵母正常编码合成氨基酸的酶基阅。86. 酵母的转化过程一般是先用酶消化细胞壁形成原生质体，经氯化钙和聚乙二醇处理，使质粒 DNA 进入细胞，然后在允许细胞壁再生的选择培

38、养基中培养。87. Y1p 型载体比较简单，属于穿梭质粒、自我复制型载体，由大肠杆菌质粒和酵 母的 DNA 片段构成的。Y1p 型载体在酵母细胞中不能自主复制。88. Ylp 型载体含有 4 个主要部分：（1）多克隆位点；抗氨苄青霉素基因 Amp ；大肠杆菌复制起点；（4）尿嘧啶原养型基刚 UrU3+。89. YRp 型载体是酵母的 DNA 片段插入到大肠杆菌质粒巾构成的，它同时含有大肠 杆菌和酵母的自主复制基因，能在两种细胞中存在和复制。90. YEp 型载体一般南大肠杆菌质粒、2gmi 质粒以及酵母染色的的选择标记构成。91. 在酵母中使用的克隆载体都存在着稳定性与拷贝数之间的矛盾。能够稳

39、定遗传的（Yip，YCp）都是单拷贝；而拷贝数高的（YRp，Yep）又都不稳定。因此在基因操 作中，要根据不同的使用目的进行选择和改造载体。92. 酵母人丁染色体（YAC）是目前能克隆最大 DNA 片段的载体，可插入 l00 - 2000 kh 的外源 DNA 片段。93. 存原核表达载体巾通常使用的可调控的强启动子有 lac （乳糖启动子）、trp （色 氨酸启动子）、PL 和 PR （入噬菌体的左向和右向启动子）以及 tac （乳糖和色氨 酸的杂合启动子）等。94. 根据转录终止作用类型。原核生物转录终止子可以分为两类：一类是不依赖蛋 白质辅助因子而实现终止作用，又称“强终止子”；另一类是

40、依赖蛋白质辅助因子 才能实现终止作用，又称为“弱终止子”，这种辅助因子常称为p因子。95. 真核表达载体的典型表一植物细胞的Ti 质粒表达载体、昆虫细胞的杆状病毒表达载体和哺乳动物细胞的 SV40 病毒表达载体。96. 用于扩增基因的 PCR 方法有：RT - PCR、锚定 PCR 连接介导的 PCR 盒式PCR RACE97. 只知道 DNA 一端的序列又要对未知的一端进行测序时和对体内甲基化图谱或DNA 印迹进行分析时，就需要用到连接介导的PCR98. 到目前为止，DNA 的合成方法有液相磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸.三酷法，以及阔相磷酸三酯法和亚磷酸三酯法及自动合成法。99. 同相亚磷

41、酸王酯法，是目前最通用的一种合成寡核苻酸的方法。100. 根据 DNA 片段的来源可分为基团组义库和 cDNA 义库，而根据克隆载体的不同 可分为质粒文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库等。101. 在基因组文库载体选用上，细菌人丁染色体（BAC）由于具有容量大、稳定性好、易于操作等优点，受到研究者的青睐。BAC 载体是在大肠杆菌 F 因子的基础上建立的。102. 将外源重组体分子导人受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔（电转化）等多种不同的方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原 核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应川于高等动植物的真核细胞。103.

42、 文库构建完成后，需要对文库进行评价，评价一个基因纽文库质量高低的标 准是文库巾克隆的数量，插入片段大小，细胞器 DNA 勺含量及假阳性克隆的含量。104. 日前实验室巾提取细胞总 RNA 的方法主要有：胍盐/氯化铯密度梯度超速离 心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。105. 定点突变中不依赖PCR 的诱变方法有：盒式诱变、寡核背酸介导的诱变、Kunkel 法。106. 随机突变包括化学或物理诱变法以及PCR 随机诱变法。107. DNA 改组，作为一种高通量的突变和筛选技术，不仅可以实现基因序列的点突变，还可以实现其他突变技术不能实现的基因片段捅入、缺失、倒转和整合等， 而且可以反复改组，实现突变

43、的优势积累效应。DNA 改组实际上是依赖于 PCR 的体外诱变技术。108. 常用的原核受体细胞主要有大肠杆菌、枯草杆菌和蓝细菌等；109. CaCb 法是.日前常 JH 的感受态细胞制备方法，它虽不及RhCl （ KCl）法转化效率较高，但其简便易行，且其转化效率完全可以满足一，般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 I5%的无菌甘油于-70C保存（半 年），因此 CaCl2法的使用更广泛。110. 接合转化是通过供体细胞同受体细胞问的直接接触而传递外源DNA 的方法。主要刚于微生物细胞的基因转化。111. 依据载体的选择性标记对转化子进行初步筛选，包括：抗药性筛选、显色

44、筛 选法、营养缺陷型筛选法和噬菌斑筛选法。112. 常 JH 抗生素有：氨苄青霉素、羧苄青霉素、甲氧两林、卡那霉素、氯霉素、 链霉素、萘啶酮酸和四环素。113. 常用的一种显色筛选法是蓝白斑筛选法。114. 用于原核表达系统的宿主菌有多种，除了大肠杆菌外，目前应用的还有芽抱杆菌、链霉菌和蓝细菌（蓝藻）等。115. 目前应用较多的芽抱杆菌宿主菌有枯草芽抱杆菌、短小芽抱杆菌、地衣芽抱 杆菌、嗜碱芽抱杆菌、淀粉芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、球形芽抱杆菌、短芽抱杆 菌、嗜热脂肪芽抱杆菌、耐碱的芽抱杆菌和苏云金芽抱杆菌等。116. 不管是哪种表达系统，都应包括启动子、终止子、SD 序列、选择标记基、复制子等要

45、素。117. 启动子除了有强启动子和弱启动子之分外，由于RNA 聚合酶和启动子结合的6过程还涉及其他蛋 H 因子的作用，所以启动子又可分为组成型和凋控型。在原核 表达系统中，大部分表达载体采用调控型启动子控制目的基因的表达。118. 目前，大量生产蛋白质最常用的是冷反应启动子 cspA、lac 启动子（乳糖启 动子）、trl）启动子（色氨酸启动子）、入噬菌体 P-启动子（入噬菌体的左向启动 子）、tac 启动子（乳糖和色氨酸的杂合肩动子）等。119. mRNA 在细菌巾的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即SD 序列以及 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的距离。这是因为细菌在翻译水

46、平上的调控是 不严格的，只有，mRN 劇核糖体的结合，才是蛋白质合成的关键。120. 原核生物的转录终止子可以分为两类：依赖于p因子的终止子（弱终止子） 和不依赖于p因子的终止子（强终止子）。在构建表达载体时，一般使用强终止子 终止外源基因的表达。121. 由于遗传密码的简并性，除个别氨基酸（色氨酸和甲硫氨酸）外，大多数氨 基酸都具有两个或者两个以上的密码子。122. 在原核生物巾表达外源基时，由于载体构建时所选择的构件序列不同，一 些载体可川于表达融合型蛋白，一些载体可用于表达非融合蛋白，还有一些载体 可用于表达分泌型蛋白。123. 外源基因表达产物在细胞质中过度积累会影响细胞的生理功能，并

47、给后续的 分离纯化带来一定困难。将外源基因的产物以分泌型蛋白的形式来表达则可以解 决上述问题。124. 大肠杆菌中某些蛋白质属于分泌性蛋白质，可以被分泌到细胞膜外的问质中， 这是由于在这些蛋白质的 N 端存在着一段称为信号肽的多肽。125. 常见的深层培养方式：分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养、固 定化培养。126. 分批培养主要分为四个阶段：延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。127. 常见的细胞破碎方法有变性剂裂解法、超声波破碎法、机械破碎法、酶解法 和反复冻融法。128. 分泌蛋白质的浓缩方法包括沉淀法、超滤法、吸附/洗脱层析等。超滤法是 日前最常用的蛋白质溶液浓缩方法。129

48、. 基因丁程产生的第一个标准生产和应用的药物是人胰岛素。130. 常用的病毒载体有逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体等。131. 逆转录病毒是病毒性载体中应用最早、研究相当成熟且仍被广泛应用的载体。132. 为提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，还可以存原来的病毒Env 上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体（bc-Fv）。133. 慢病毒也属于逆转录病毒家族，它可以感染分裂细胞又可感染非分裂细胞。 最为人们熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV）。134. 腺病毒是无包膜的线性双链 DNA 病毒，在自然界分布广泛。135. COS 细胞系的优点在于重组基阂得到高效复

49、制，每个转染的细胞可产生105拷贝。但由于染色体外 DNA 大量积累会导致细胞死亡，因此，cos 细胞不能建立 稳定的细胞株，但作为基因暂时性表达的研究是一种很好的系统。136. 其他外源 DNA 导人动物细胞的方法还有：超声波法、显微注射法、原生质体 融合法和病毒感染法。137. 不能列入转基冈动物范畴的实例包括：由于化学品的诱变作肘导致基发生 改变：由于辐射作川导致基因发生改变；由于化学品或辐射的作川使染色体发生 畸变；通过核移植交换遗传物质以及使川基因治疗技术导人 DNA 等o138. 显微注射法是最先获得的转基因哺乳动物的基因操作方法。139. 1983 年首例转基因植株诞生，标志着植

50、物基因工程技术开始从实验室走进田闯，走向应用。140. 愈伤组织可分为胚性和非胚性愈伤组织两种类型，两者在外观上有所不同。141. 胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在生化代谢方面也存在差异，胚性愈伤组织 在总核酸、DNJL RNA 可溶性蛋白含量上均高于非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织 的代谢也较活跃。142 .体细胞胚胎发生途径是所有基因转化受体中最理想的转化受体。143. 植物病毒载体分为 3 种，双链 DNA 病毒、单链 DNA 病毒和单链 RNA 病毒。144. 目前，根据冠瘿瘤中所合成冠瘿碱的种类不同， Ti 质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型或称琥珀碱型。1

51、45. 目前，用于开发载体及转化的病毒有三种：（1）花椰菜花叶病毒（CaMV） （2）双联体病毒；（3）RNA 病毒。它们主硬采用基因插人和基因取代的方法构建载体。146. 目前已发展出的高等植物基因表达系统包括：外源基因的四环素诱导系统（Tc-on 型四环素诱导系统、Tc - off 型四环素阻遏系统）、外源基内的乙醇诱导 系统、外源基闪的类固醇诱导系统（糖皮质激素诱导系统、雌激素诱导系统） 。147. 目前通过基鬨工程方法，在作物巾转入各种特定基闪，如：抗植物病虫害基 因（Bt 基阂、蛋向酶抑制剂基因等）、抗植物病毒的基因（病毒外壳蛋白基因、干扰素基因等）、抗植物真菌病害的基因（几丁质酶基

52、因、抗毒素基因等）、抗植物细菌病害的基因（杀菌肽基因、溶菌酶基因等），获得了各种抗虫、抗病作物新 品种；而转入各种抗非生物胁迫的基因（耐除草剂基因、抗冻蛋白基因、脯氨酸 合成酶基因、甜菜碱合成酶基因、调渗蛋白基因等），则可提高作物抗逆能力；转入特定药用功能蛋白的基因（人胰岛素、干扰素、白细胞介素、免疫球蛋白等），则可利用植物体作为生物反应器生产活性多肽、抗体和疫苗等药物产品。148.1999 年南美国疾病预防控制中心及国立卫生研究院（CDC/NIH）发表了第四版微生物和生物医学实验室生物安全手册（BMBL,），该标准日前已是国际通/U 的“金标准”，2007 年义更新到第五版。149. 基因工

53、程产品即转基因生物（GMOs 包括转基因动物、转基因植物和转基因微 生物 3 大类。150. 目前，欧盟成为世界上转基因产品管理最严格的地区。151. 专利法第二十五条规定，对下列各项，不授予专利权：（一）科学发现；（二）智力活动的规则和方法；（三）疾病的诊断和治疗方法；（四）动物和植物品种；（五）用原子核变换方法获得的物质。对前款第（四）项所列的生产方法， 可以依照本法规定授予专利权。152. CcnBank EMBL DDBJ 是现在国际上最主要的三大核酸序列数据库。153. 基闪芯片产生的基础是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激 光技术和讨.算机科学的发展及其有机结合。154

54、. 肌肉、心肌、血管、肝、脑、皮肤、呼吸道、黏膜、肿瘤等组织均可作为基 因治疗的靶组织，最常用的靶组织为骨骼肌组织。155. 基因治疗的基本策略包括：基因置换、基因矫正、基因修饰、基因抑制、基 因封闭。156. 蛋白质丁程的应用包括：提高蛋白质的稳定性.融合蛋白质、蛋白质活性的 改变、治癌酶的改造、嵌合抗体和人源化抗体。三、简答和论述1. 基因工程技术的应用前景：（1） 应用重组 DNA 技术培育具有改良性状的粮食作物。（2） 利用基因工程技术大量生产哺乳动物的蛋白质。重组 DNA 技术可以促进医学研究的发展。基因诊断与基因治疗是基因工程在医学领域发展的一个重要方面。（5） 分子生物学新技术的

55、不断涌现推动了基因工程的迅速进步。2. DNA 的半保韶复制：当 DNA 复制时，2 条链解开形成单链，然后以每条单链为模板，在酶的催化下， 按奠嚣碱基配对原则合成新的子代 DNA 分子。子代 DNA 分子中，保留了一条完整 的亲代 DNA 连，另一条链则是新合成的。3. 与原核生物基因组比较，真核生物基因组的结构与功能特点：（1）真核生物基因组的结构和功能比原核生物复杂。 真核生物基因的转录和翻译在细胞的不同空间进行（2） 除染色体基因组外，真核生物还具有线粒体基因组，植物细胞叶绿体内也有遗 传物质。7（3） 每种真核生物都有一定数目的染色体，两份同源的基因组口（4） 真核基因组远远大于原核

56、生物的基因组，结构复杂。真核生物都南结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子。（6） 非编码的顺序占绝大部分，含有大量重复顺序。（7） 具有内含子结构，普遍存在选择性剪接。（8） 功能相关的基冈构成各种基闲家族。4. 常见的 DNA -蛋白质结合域：（1）螺旋一转角一螺旋，这种结构模式具有两个较短的a螺旋片段，每个片段有 7-9 个氨基酸残基，两个螺旋片段之间由B转角结构联系。一个a螺旋被认为是识别螺旋，含有较多能与 DNA 相互作用的氨基酸残基，此螺旋进入DNA 双螺旋结构的大沟。（2） 锌指，锌指结构含有约 30 个氨基酸残基，其中 4 个氨基酸残基（两个是半胱 氨酸两个是组氨酸，或

57、 4 个都是半胱氨酸）以配位键与 ZrT 相互作用。这种结构 模式在多种真核转录闪子的 DNA 吉合结构域中存在，而且都具有多个相同的锌指，转录因子 TFIIIA （与转录 SSRNAS因有关）具有 9 个锌指，每个锌指都能与 DNA 双螺旋大沟结合。5. 真核基因表达调控与原核基因的显著差异：（1） 转录激活与染色体转录区特定结构相适应。（2） 正性调节占主导。（3） ）转录与翻泽在空间上的分离。（4） 更多、更复杂的调控蛋白。6. 碱裂解法提取质粒 DNA 的原理：碱裂解法是小量制备 DNA 较好的方法。基本原理是利用质粒较小且为超螺旋共价 闭合环状分子的特点，它与染色体DNA 在拓扑学上

58、有很大差异来分离。即在碱性pH （12 - 12.5）下，DNA 分子均变性，恢复中性时，线性染色体DNA 由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性，就与其他成分 共沉淀，而质粒 DNA 分子小且两条闭合环状分子即使变性也较紧密地缠绕在一起， 准确复性而留在上清溶液中。7. 碱抽提法提取质粒 DNA 过程中所用的 NaOH-SDS 溶液的作用：核酸在 pH5 -9 的溶液中是稳定的，但当 pH 12 或 pH 300 kb)能够复制严谨、稳定。(2) 通过电击法转化大肠杆菌的效率较高。(3) 以超螺旋状态存在，分离抽提比 YAC 容易。(4) 克隆中几乎不存在嵌合体。1

59、9. cDNA 文库的质量评价：目前，主要通过两个方面来对 cDNA 文库的质量进行评价。(1)文库的代表性，cDNA 义库的代表性是体现文库质量最重要的指标，它是指构 建的 cDNA 文库巾包含的重组 cDNA 分子所反映的来源细胞巾表达信息，即 mRNA 申类的完整性。重组 cDNA 片段的序列完整性，指在细胞巾表达出的各种 mRNAt 段的序列完整 性。20. mRNA 差异显示技术(DDRT - PCR)的基本原理：DDRT- PCF 技术以逆转录反应、PCF 反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础。其基本 原理是，以一对细胞(或组织)的总 JINA 反转录而成的 cDNA 为模板，利用 PC

60、R 的高效扩增，通过5/端与 3/端引物的合理设计和组合，将细胞(或组织)中表 达的约 15000 种基因片段直接显示在 DNA 测序胶上，从而找出一对细胞(或组织) 中表达有差异的 cDNA 片段。对获得表达差异的基因片.段进行回收、克隆、鉴定 及分析。21. PCR 介导定点诱变的优缺点：主要优点：(1)突变体回收率高；(2)能以双链 DNA 为模板，并几乎可在任何位 点引入突变；(3)高温度的利用，可降低模板 DNA 形成二级结构的能力，这些结构 会使单链 DNA 模板的延伸反应效率降低；(4)可利用商业试剂盒；(5)快速简便。 不足之处：(I) PCR 产物有相对高的错误率，但是可以通