副溶血性弧菌检验技术

1、食品中副溶血性弧菌检验u 副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现，大多在温暖的季节水体中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。u副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈腹痛。所有的副溶血性弧菌胃肠炎起因均是由于进食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有副溶血型弧菌引发的胃肠炎相当普遍，约占全部胃肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。一、副溶血性弧菌概况p海洋环境中副溶血性弧菌的浓度通常为102CFU/mL或更低。而该菌引发的胃肠炎仅在摄入大量细菌（106CFU）时才会发生。因此，只有在生吃污染严重的滤食性海鲜食品，或进食未经恰当烹饪处理的污染食品时

2、，才会引起胃肠炎。p虽然副溶血性弧菌与肉及肉制品关联不大，但在腌肉制品中曾分离到其他的嗜盐弧菌（肋生弧菌和其他未分型弧菌），并且确定为引发变质的微生物。由于副溶血性弧菌存在于海鲜食品中，随着鱼肉来源的食品添加物质如鱼糜等在肉制品中应用越来越多，未来由副溶血性弧菌引发的问题将不容忽视。一、副溶血性弧菌概况u形态学特征：革兰氏染色阴性；菌体呈直或弯曲杆状；单极鞭毛具动力，有时在固体培养基中生长后可产生周生鞭毛；培养特性：嗜盐，在含氯化钠(20-30gL最适) 培养基上生长，无盐和110gL以上不生长。最适为37，4 不生长。最适pH为7.4-8.0。需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢。n抵抗力： 不耐

3、热，对酸敏感（在2冰醋酸或食醋中立即死亡），对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感，对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。一、副溶血性弧菌概况二、GB 4789.7-2013 标准解读副溶血性弧菌检验食品微生物学检验食品安全国家标准本标准规定了食品中副溶血性弧菌（本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolytcusVibrio parahaemolytcus）的检）的检验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。1 范围二、GB 4789.7-2013 标准解读除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2 设备和材

4、料2.1 2.1 培养箱：培养箱：36361 2.2 1 2.2 冰箱：冰箱：2255，771010 2.3 2.3 恒温水浴锅：恒温水浴锅：36361 1 2.4 2.4 均质器或无菌乳钵均质器或无菌乳钵 2.5 2.5 天平：感量天平：感量0.1g 2.6 0.1g 2.6 无菌试管：无菌试管：18mm18mm180mm180mm、15mm15mm100mm100mm2.7 2.7 无菌吸管：无菌吸管：1mL1mL（具（具0.01mL0.01mL刻度）、刻度）、10mL10mL（具（具0.1mL0.1mL刻度）或微量移液器及吸头刻度）或微量移液器及吸头 2.8 2.8 无菌锥形瓶：容量无菌

5、锥形瓶：容量250mL250mL、500mL500mL 1000mL 2.91000mL 2.9 无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90mm 2.10 90mm 2.10 全自动微生物生化鉴定系统全自动微生物生化鉴定系统 2.11 2.11 无菌手术剪、镊子无菌手术剪、镊子 二、GB 4789.7-2013 标准解读3 培养基和试剂3.1 3%3.1 3%氯化钠碱性蛋白陈水（氯化钠碱性蛋白陈水（APWAPW） 3.2 3.2 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBSTCBS）琼脂）琼脂3.3 3%3.3 3%氯化钠胰蛋白陈大豆（氯化钠胰蛋白陈大豆（TSATSA）琼脂）琼脂

6、 3.4 3% 3.4 3%氯化钠三糖铁（氯化钠三糖铁（TSITSI）琼脂）琼脂3.5 3.5 嗜盐性试验培养基嗜盐性试验培养基 3.6 3% 3.6 3%氯化钠甘露醇试验培养基氯化钠甘露醇试验培养基3.7 3%3.7 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基 3.8 3% 3.8 3%氯化钠氯化钠MRMRVPVP培养基培养基3.9 3%3.9 3%氯化钠氯化钠 3.10 3.10 我妻氏血琼脂我妻氏血琼脂3.113.11氧化酶试剂氧化酶试剂 3.12 3.12 革兰氏染色液革兰氏染色液 3.13 ONPG3.13 ONPG试剂试剂 3.14 Voges 3.14 Voge

7、sProskauerProskauer（V VP P）试剂）试剂 3.15 3.15 弧菌显色培养基。弧菌显色培养基。 3.16 3.16 生化鉴定试剂盒生化鉴定试剂盒 二、GB 4789.7-2013 标准解读二、GB 4789.7-2013 标准解读样品25g（mL）+225mL 3氯化钠碱性蛋白胨水接种3氯化钠碱性蛋白胨水3管，3个适宜的连续稀释度361 818hTCBS或科弧菌显色培养基划线分离挑取可疑菌落，接种于3氯化钠碱性蛋白胨大豆琼脂361 1824h筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验361 1824h 生化试验或先用API 20E生化鉴定试剂或VIT

8、EK结果与报告定性定量361 818h血清学试验、神奈川试验（选做项目）4 检验程序二、GB 4789.7-2013 标准解读5.1 样品制备5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置710冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45以下不超过15min或在25不超过18h解冻。5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求相应部分。5 操作步骤GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.1.3 以无菌操作样品2

9、5g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min,或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3%氯化钠碱性蛋白水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品12次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1：10的样品匀液。二、GB 4789.7-2013 标准解读5.2 增菌5.2.1 将5.1.3制备的1：10样品匀液于361培养8h18h。5.2.2 定量检测5.2.2.1 用无菌吸管1：10样品匀液1m

10、L，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，准备1：100的样品匀液。5.2.2.2 另取1mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3%绿化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置361恒温箱内，培养8h18h。5 操作步骤二、GB 4789.7-2013 标准解读5.2 增菌5.2.1 将5.1.3制备的1：10样品匀液于361培养8h18h。5.2.2 定量检测5.2.2.1 用无菌吸管1：10样品匀液1mL

11、，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，准备1：100的样品匀液。5.2.2.2 另取1mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3%绿化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置361恒温箱内，培养8h18h。5 操作步骤GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液， 用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。

12、一支试管划线一块平板。于361培养18h24h。5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液， 用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于361培养18h24h。5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS

13、上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.4 纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，361培养18h24h。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.5 初步鉴定5.5.1 氧化酶试验：挑取纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 5.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形

14、态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽孢，有鞭毛。5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，361培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。5.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，361培养24h，观察液体浑浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.6 确定鉴定取纯

15、培养物分别接种含有3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，361培养24h48h后观察结果：3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。GB 4789.7-2013 标准解读6 结果与报告根据检出的可疑菌落生化性状，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性试管管数，查最可能数（MPN检索表），报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌细胞数量增殖三、副溶血性弧菌定性检测液体样品摇匀25mL均质固体样品225ml 3%氯化钠碱性蛋白陈水25g361818h典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。操作规程TCBS琼脂科玛嘉显色琼脂接种于3氯化钠碱性蛋白胨大豆琼脂氧化酶试验革兰氏染色3氯化钠TSI嗜盐性试验甘露醇试验赖氨酸试验MRVPONPG结果鉴定三、副溶血性弧菌定性检测副溶血性弧菌的生化性状试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，无芽胞氧化酶动力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶V-PONPG注：阳性；阴性。当检出的可疑菌落符合生化性状要求时，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。操作规程四、副溶血性