分子生物学L3断裂基因

1、分子生物学L3断裂基因Chapter 2The interrupted gene(断裂基因)2.1 Introduction2.2 Restriction endonucleases are a key tool in mapping DNA (限制性内切核酸酶是DNA作图中的关键工具 (2.3) )2.3 Organization of interrupted genes may be conserved (断裂基因的组成结构可能是保守的 (2.4) )2.4 Genes can be isolated by the conservation of exons (通过外显子的保守性可以分离基

2、因 (2.6) )2.5 Some DNA sequences code for more than one protein (一些DNA序列编码一种以上蛋白质 (2.8) )2.6 The members of a gene family have a common organization (基因家族成员具有共同的组织结构 (2.11) )Key Concepts：Eukaryotic genomes contain interrupted genes that consist of an alternation of exons (represented in the final RNA

3、 product) and introns (removed from the initial transcript).The exon sequences occur in the same order in the gene and in the RNA, but an interrupted gene is longer than its final RNA product because of the presence of the introns.关键概念：关键概念：真核生物基因组包含的断裂基因由间隔的外显子 (最终以RNA产物体现)和内含子 (从初始转录物中去除的序列)组成。外显子

4、(外元)序列在基因和RNA中的顺序是一致的，但由于内含子(内元)的存在，断列基因的长度大于它的最终RNA产物的长度。2.1 IntroductionThe exons are the sequences represented in the mature RNA. By definition, a gene starts and ends with exons, corresponding to the 5 and 3 ends of the RNA. The introns are the intervening sequences that are removed when the pri

5、mary transcript is processed to give the mature RNA.外显子外显子的序列包含在成熟RNA中。也可以是基因起始、结束于外显子对应于RNA的5和3端。内含子内含子是插入序列，在初始转录物加工成成熟RNA时被除去。Figure2.1 Interrupted genes are expressed via a precursor RNA. Introns are removed when the exons are spliced together. The mRNA has only the sequences of the exons.内含子从断裂

6、基因中去除后形成信使RNA外显子1剪接去除内含子前体mRNA前体RNA(非mRNA)的长度决定基因的区域每个编码区域在基因中是彼此分离的图图2.12.1 断裂基因表达成前体RNA，内含子剪切除去后，外显子剪接连接在一起，而mRNA只有外显子的序列。2.2 Restriction endonucleases are a key tool in mapping DNA (限制性核酸内切酶是DNA作图中的关键工具) (2.3)Key Concepts Restriction endonucleases can be used to cleave DNA into defined fragments.

7、 A map can be generated by using the overlaps between the fragments generated by different restriction enzymes.关键概念关键概念限制性内切核酸酶可以用来将DNA剪切成特定的片段。用不同的限制性内切核酸酶作用，可产生一系列DNA片段，通过叠加方法可用于DNA作图(物理图谱)。 物理图谱物理图谱（Physics Map）：物理图谱描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离(以碱基对的数目为衡量单位)，这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，基因等。物理图谱不考虑两个标记共同遗传

8、的概率等信息。对于人类基因组来说，最粗的物理图谱是染色体的条带染色模式，最精细的图谱是测出最精细的图谱是测出DNA的完整碱基序列。的完整碱基序列。物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。 bp is an abbreviation for base pairs; distance along DNA is measured in bp.Restriction enzymes recognize specific short sequences of DNA and cleave

9、the duplex (sometimes at target site, sometimes elsewhere, depending on type).bp 是碱基对的缩写；用以测量DNA中的距离。限制性核酸内切酶可以识别双链DNA上的特异的短序列并切开双链结构(根据基因的不同类型，切割可以在靶位点或其它位置)。Restriction map is a linear array of sites on DNA cleaved by various restriction enzymes.Restriction endonucleases can be used to cleave DNA

10、into defined fragments. A map can be generated by using the overlaps between the fragments generated by different restriction enzymes. 限制图谱是DNA经不同限制性内切酶切割后的线性排列。限制性内切酶可将DNA切成一定长度的片段。利用由不同限制性内切酶切割所产生的片段之间的重叠性质可绘制DNA图谱。Figure 2.3 Fragments generated by cleaving DNA with a restriction endonuclease can

11、be separated according to their sizes.图2.3 限制酶作用产生的DNA切割片段能按照它们的大小而分开。电泳可根据大小分离片段电泳可根据大小分离片段与对照相比的片段大小对照含有一系列已知大小的片段用限制性核酸内切酶切割电泳、与对照DNA对比Figure2.4 A restriction map is a linear sequence of sites separated by defined distances on DNA. The map identifies the sites cleaved by enzymes A and B, as defin

12、ed by the individual fragments produced by the single and double digests. 限制图谱图图2.4 限制图谱表示的是DNA上以限定长度而分开的所有位点的线性次序。该图确定了酶A及B的酶切位点，它们由单酶切和双酶切消化所产生的不同片段来确定。2.3 Organization of interrupted genes may be conserved (断裂基因的组成结构可能是保守的) (2.4)由于内含子额外序列的存在，并通过限制图谱或电子显微镜技术比较基因与它们的RNA产物而使内含子能够被检测出来，但最终的定义是通过比较序列而

13、得出的。比较不同生物的同源基因，我们发现内含子的位置通常是保守的，但是相应的内含子的长度变化可以很大。内含子通常不编码蛋白质。 Figure 2.5 Comparison of the restriction maps of cDNA and genomic DNA for mouse -globin shows that the gene has two introns that are not present in the cDNA. The exons can be aligned exactly between cDNA and gene. cDNA中缺失内含子的限制位点限制位点基因组

14、DNA图图2.5 比较- 珠蛋白的cDNA和基因组DNA的限制图谱，我们发现基因有两个内含子而cDNA中则没有。在cDNA和基因组DNA中，外显子限制图谱排列是一致的。Figure 2.6 An intron is a sequence present in the gene but absent from the mRNA (here shown in terms of the cDNA sequence). The reading frame is indicated by the alternating open and shaded blocks; note that all thre

15、e possible reading frames are blocked by termination codons in the intron. 内含子序列mRNA中去除阻断图图2.6 内含子就是包含在基因中但在mRNA中缺失的一段序列 (此处显示的是cDNA序列)。读框用交互开放和阴影区表示；值得注意的是三个可能的读框被内含子中的终止密码子所阻断。Figure 2.7 All functional globin genes have an interrupted structure with three exons. The lengths indicated in the figure

16、 apply to the mammalian -globin genes. 珠蛋白基因具有相似的结构，但内含子的长度不同珠蛋白基因具有相似的结构，但内含子的长度不同图图2.7 所有功能性珠蛋白基因都是含三个外显子的断裂基因结构。图中标识的长度亦适用于哺乳动物- 珠蛋白基因。内含子长度内含子长度包含UTR（Untranslated Regions)即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子两端的非编码片段。 5-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。 珠蛋白基因 globin gene 血红蛋白

17、含2个和2个链，分别由链珠蛋白基因和链珠蛋白基因的信息而形成。哺乳动物的链基因和链基因在结构上相似，都是由2个内含子而分为3个外显子部分。链基因和链基因的内含子1的长度约为120个碱基对，而对内含子2，链很长（例如人的链基因之一的2，内含子2含140个碱基对，而链基因含849个碱基对）。珠蛋白基因在哺乳类是数次重复的结构，形成一种多重基因群。珠蛋白珠蛋白（英文名为“globinglobin”）是具有携带氧能力的蛋白质携带氧能力的蛋白质。在脊椎动物体内有两种类型：即存在于血液中血红蛋白和肌肉中肌红蛋白，目前在神经系统又发现了第三种珠蛋白。Figure 2.8 Mammalian genes fo

18、r DHFR have the same relative organization of rather short exons and very long introns, but vary extensively in the lengths of corresponding introns.图图2.8 哺乳动物的DHFR基因具有相似的构成，即它有较短的外显子和较长的内含子，但相应的内含子之间的长度变化广泛。DHFR：二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 (dihydrofolate reductase) DHFR基因具有一个不变的结构基因具有一个不变的结构Conservation of exon

19、s can be used as the basis for identifying coding regions by identifying fragments whose sequences are present in multiple organisms. 外显子的保守性可以做为鉴定编码区的基础，即通过确认那些在许多生物体中都存在的序列片段。2.4 Genes can be isolated by the conservation of exons (通过外显子的保守性可以分离基因) (2.6)Key Concepts关键概念关键概念In a region containing a

20、gene whose function has been conserved among a range of species, the sequence representing the protein should have two distinctive properties :it must have an open reading frame (open reading frame, ORF);it is likely to have a related sequence in other species.对于含有这样基因的区域，即在许多生物中这些基因的功能长期被保留下来，这个序列所

21、代表的蛋白质应当有两个特性：它必须有一个开放阅读框 (ORF)；在其他生物中很可能存在与它相关的序列。Southern blotting基本概念及原理基本概念及原理Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条

22、件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即

23、分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。Another technique that allows genomic fragments to be scanned rapidly for the presence of exons is called exon trapping shows that it starts with a vector that contains a strong promoter, and has a single intron between two exons. When this vector is tr

24、ansfected into cells, its transcription generates large amounts of an RNA containing the sequences of the two exons. 另外一种技术即对基因组片段迅速扫描从而得知外显子的存在叫外显子捕外显子捕获获技术。外显子捕捉外显子捕捉技术要求一个带有强启动子的载体且在两个外显子之间只有一个内含子。当这个载体转染到细胞后，转录产生大量的含有两个外显子序列的RNA。Figure 2.12 A special splicing vector is used for exon trapping. If

25、 an exon is present in the genomic fragment, its sequence will be recovered in the cytoplasmic RNA, but if the genomic fragment consists solely of sequences from within intron, splicing does not occur, and the mRNA is not exported to the cytoplasm.3 剪接点5 剪接点 转录和剪接载体在转录物中含有两个通过剪接剪接连在一起的外显子图图2.12 此技术用

26、了一种特殊的载体。如果基因组片段中含有一个外显子，那么它的序列可以在细胞质RNA中被发现；但如果基因组片段中只由内含子中的序列组成，那么剪接就不会发生，且mRNA也不会运输到细胞质中。一特殊载体用于外显子捕捉基因组片段转录和剪接外显子插基因组片段到内含子中2.5 Some DNA sequences code for more than one protein (一些DNA序列编码一种以上蛋白质) (2.8)Key Concepts The use of alternative initiation or termination codons allows two proteins to be

27、 generated where one is equivalent to a fragment of the other. Nonhomologous protein sequences can be produced from the same sequence of DNA when it is read in different reading framesby two (overlapping) genes. Homologous proteins that differ by the presence or absence of certain regions can be gen

28、erated by differential (alternative) splicing, when certain exons are included or excluded. This may take the form of including or excluding individual exons or of choosing between alternative exons.起始 (或终止)的可选择性可以产生相关的蛋白质全长蛋白质部分长度蛋白质选择性起始点Figure 2.17 Two proteins can be generated from a single gene

29、 by starting (or terminating) expression at different points.图图2.17 通过在不同的起始位点起始表达或在不同的终止位点终止表达, 一条基因可以翻译出两种不同的蛋白质。Figure 2.18 Two genes may share the same sequence by reading the DNA in different frames.不同的阅读框可以使用重叠的三联体密码子蛋白质1的密码子蛋白质2的密码子图2.18 通过使用不同的读框,两条基因可共享一段DNA序列。可变剪接可以替代外显子Figure 2.19 Alterna

30、tive splicing generates the and variants of troponin T (可变剪接产生肌钙蛋白T的和两种类型).可变剪接使用不同外显子的组合只有内含子被剪接除去长蛋白质有三个外显子内含子+外显子2被剪接除去短蛋白质只有外显子1+外显子3Figure 2.20 Alternative splicing uses the same pre-mRNA to generate mRNAs that have different combinations of exons. 图图2.20 可变剪接使用相同的前体mRNA，产生的mRNA含有不同的外显子组合。(一组基因

31、假定具有共同特征，可以鉴定出在进化过程中这组基因分开之前的一些性质)(所有的珠蛋白都具有3个外显子和2个内含子这种共同的组织形式，这意味着它们由一个祖先基因进化而来 )Key ConceptsA common feature in a set of genes is assumed to identify a property that preceded their separation in evolution. All globin genes have a common form of organization with 3 exons and 2 introns, suggesting

32、 that they are descended from a single ancestral gene.2.6 The members of a gene family have a common organization (基因家族成员具有共同的组织结构) (2.11)Figure 2.24 The exon structure of globin genes corresponds with protein function, but leghemoglobin has an extra intron in the central domain.图图2.24 珠蛋白基因的外显子结构与蛋

33、白质的功能相一致，但是豆血红蛋白的中央结构域中含有一个额外的内含子。结构域是被分开的亚铁血红素结合域豆血红蛋白有一个额外的内含子珠蛋白豆血红蛋白豆血红蛋白珠蛋白珠蛋白（英文名为“globin”）是具有携带氧能力的蛋白质携带氧能力的蛋白质。在脊椎动物体内有两种类型：即存在于血液中的血红蛋白和肌肉中的肌红蛋白，目前在神经系统又发现了第三种珠蛋白。豆科植物根瘤中的血红蛋白血红蛋白，亦称为根瘤血红蛋白。这是1939年久保秀雄发现的。 豆血红蛋白关系着根瘤菌固氮的有效性。 豆血红蛋白存在类菌体的周围，有截留和释放氧分子的功能，既为类菌体有截留和释放氧分子的功能，既为类菌体的呼吸作用源源提供分子氧的快速细

34、流，又保护了类菌体内固氮酶免与氧直的呼吸作用源源提供分子氧的快速细流，又保护了类菌体内固氮酶免与氧直接接触而受破坏接接触而受破坏。豆血红蛋白存在于植物细胞的液泡中，对氧具有很强的亲和力，因此对创造固氮作用所必须的厌氧条件是有利的。 Figure 2.25 The rat insulin gene with one intron evolved by losing an intron from an ancestor with two interruptions.图图2.25 大鼠胰岛素祖先基因含有两个内含子，进化过程中丢失了一个，从而其基因结构是由一个内含子间隔两个片段。普通胰岛素基因 (鸡&

35、amp;大鼠)大鼠的第二条胰岛素基因引导大鼠胰岛素基因丢失了一个大鼠胰岛素基因丢失了一个外显子外显子丢失内含子丢失内含子引导编码内含子外显子内含子外显子编码编码外显子在肌动蛋白的基因进化中，内含子发生了很多变化Actin genes vary widely in their organization. The sites of introns are indicated in purple (肌动蛋白基因的构成变化很大，内含子的位置在图中以紫色标示) Figure 2.26 (19个不同的位置, 1% in the population. (我们把在一个基因座上有多条等位基因的现象称作遗传多态

36、性遗传多态性（genetic polymorphism ）。当多条等位基因在一个种群中稳定存在时，这些等位基因当多条等位基因在一个种群中稳定存在时，这些等位基因所在的位置被认为是多态性的所在的位置被认为是多态性的。如果某条等位基因在种群中存在的概率大于1 % ，那么我们就可以认为它是多态性的。 ) A change in a single nucleotide when alleles are compared is called a single nucleotide polymorphism (SNP). One occurs every 1330 bases in the human g

37、enome. Defined by their SNPs, every human being is unique. (当比较等位基因时，其单个核苷酸的改变被称为单核苷酸多态性（SNP）。在人类基因组中，大约每1330 个碱基就有一个单核苷酸多态性。从从SNP SNP 的角度来看，每一个人的基因组都是独一无二的的角度来看，每一个人的基因组都是独一无二的，SNP 可以通过不同的方法进行检测，从直接的序列比较到质谱或者生物化学方法，这些方法都是根据在特定区域中序列的变化来显示差异的。 )Figure 3.1 A point mutation that affects a restriction s

38、ite is detected by a difference in restriction fragments.图3.1 通过检测限制片段的大小可以发现影响酶切位点的点突变DNA在一个区段上有三个靶位点突变消除了其中一个靶位点酶切产生两条内部片段有一些点突变会改变有一些点突变会改变限制图谱限制图谱酶切产生一条内部片段片段C A difference in restriction maps between two individuals is called a restriction fragment length polymorphism (RFLP). Basically a RFLP is a SNP that is located in the target site for a restriction enzyme. It can be used as a genetic marker in exactly the same way as any other marker. Instead of examining some feature of the phenotype, we directly assess the genotype, as revealed by