色谱分析 平面色谱法

1、色谱分析法色谱分析法系列课件系列课件O返回第一节第一节 概 述 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。O返回Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1Description: The thermo-stability of phospholipi

2、ds and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroform-methanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethano

3、l was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment. Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLCO返回 定义：平面色谱法(plane chromatography)是在平面上进行分离的一种色谱方法。 一、平面色谱法的分类和原理平面色谱法的分类和原

4、理分类纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。-分配色谱薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的毛细作用，展开剂（流动相）上行。 -吸附色谱薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。O返回 确定样品的预处理方法 选择吸附剂和展开剂 制备层析用薄板 点样 层析分离 显色 定性或定量分析 分析结果，给出结论O返回（一）定性参数（一）定性参数1. 比移值比移值Rf (retardation factor; Rf) 溶质移动的距离与流溶质移动的距离与流动相移动距离之比

5、动相移动距离之比 Rf范围：范围： 0 Rf 1Rf = 0.20.8（常用）（常用） Rf = 0.30.5（最佳）（最佳）LdRsf原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中O返回Lds1ds2图图181LdRsf11LdRsf22O返回2. 相对比移值相对比移值Ris 讨论讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1sisfifisddRRR中心的距离原点到参考物斑点质量心的距离原点到组分斑点质量中）（）（O返回 1、理论

6、塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度 2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原点到展开剂前沿的距离 N越大，H越小。 与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均粒径及其粒度分布等因素有关。O返回 容量因子： k=ts/tmts 、 tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间保留值的定义： 11kRtttRfmsmfO返回1、分离度分离度(resolution; R) 两相邻斑点中心的距两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值离与两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2)

7、ds1 、ds2 :分别为原点至两半斑点中心的分别为原点至两半斑点中心的距离，距离， W1、W2斑点的宽度。斑点的宽度。O返回定义：定义：相邻斑点分离度为相邻斑点分离度为1.177时，在时，在Rf=0(原点原点)到到Rf=1(溶剂前沿溶剂前沿)之之间能容纳的色谱斑点数。间能容纳的色谱斑点数。 W(1/2)0, W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处和溶剂前沿处的半峰宽。 一般薄层板的分离数为一般薄层板的分离数为 710，高效薄层板可达，高效薄层板可达1020。SN是衡量分是衡量分离容量的重要参数。离容量的重要参数。11)21()21(WWLSNoO返回 一、主要

8、类型一、主要类型 二、吸附剂与展开剂二、吸附剂与展开剂 三、操作方法三、操作方法 四、定性与定量分析四、定性与定量分析 五、高效薄层色谱法五、高效薄层色谱法 六、薄层扫描法六、薄层扫描法 七、应用实例七、应用实例O返回1TLC定义定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程操作过程：铺板铺板 活化活化 点样点样 展开展开 定位定位(定性定性)/洗脱洗脱(定量定量)3分离机制分离机制：吸附吸附* 、分配、分配*、离子交换、空间排阻离子交换、空间排阻4特点特点；分离能力强、灵敏度高、展

9、开时间较短、显色分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色 方便。方便。5应用应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。O返回O返回 （一）吸附薄层色谱 固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。 （二）分配薄层色谱 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。O返回(一）吸附剂一）吸附剂1. 硅胶：硅

10、胶硅胶：硅胶H-不含黏合剂 硅胶硅胶G-含煅石膏（13-15%） 硅胶硅胶F254- 既含煅石膏，又含荧光指示剂2. 氧化铝氧化铝：可分为：可分为中性中性（pH7.5)、碱性碱性（pH9.0）和）和酸性酸性（pH4.0） （二）展开剂二）展开剂 常用的有：常用的有： 石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化碳二硫化碳四氯化碳四氯化碳三氯乙烷三氯乙烷苯苯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷乙醚乙醚氯仿氯仿乙酸乙酯乙酸乙酯正丁醇正丁醇丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇吡啶吡啶酸酸水水O返回 展开剂的选择：展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性 吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂

11、 被测物极性弱强极性吸附剂图183O返回定性分析窄条定量分析1020cm 硅胶G自含粘和剂硅胶H不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365含荧光剂，365nm紫外光照发光（一）薄层板的制备（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，24mm（三）展开：见续页（四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等O返回 连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。1 , 2样品样品 3 标准品标准品前沿前沿原点原点 1.5-2.0cm2.0cm1 2 3O返回 二维展开在两个垂直的方向上进行

12、展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。原点12O返回定性分析 利用保留值 测定Rf值 测定相对Rf值，即Ris值。 利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致） sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开O返回定量分析 1. 目视比较半定量 2. 测量斑点面积 3. 洗脱法 4. 薄层扫描法O返回 高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography；HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小 （5m或10m），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学

13、键合相预制薄层板。O返回薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。检测方法 紫外-可见吸收测定法和荧光测定法 测量方法 投射法和反射法扫描方式 单波长和双波长影响薄层扫描定量的因素 均匀度 展开距离 随行标准及点样次序 显色均匀度及稳定性O返回 以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作与薄层法类似。 选纸 点样 展开 显色(定性)/洗脱(定量) 固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇） 分离机制：同液-液分配色谱 定性参数：讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留，Rf 小（流

14、动相极性， Rf ） 非极性组分易流出，Rf大（流动相极性，Rf ）LdsRf原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中O返回 掌握掌握: 平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。 熟悉熟悉: 薄层色谱法的主要操作步骤。薄层色谱法的主要操作步骤。 了解了解: 薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及实薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及实验条件。验条件。O返回

15、1.分析化学（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2周同惠等纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书第三卷第五册北京：科学出版社，19893林珍安等译高效薄层色谱上海：上海科技出版社，19844. 孙毓庆主编薄层扫描法及其在药物分析中的应用北京，人民卫生出版社，19905. Fried Band Sherma JThin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，19826. Grinberg NModern Thin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，1990。7. Sherma J and Fried BHandbook of Thin-Layer Chromatography. New York：Marcel Dekker lnc，1991. O返回O返回O返回O返回 相平衡参数：相平衡参数：分配系数分配系数K和和容量因子容量因子k前面推导出前面推导出 R表示单位时间内一个分子在表示单位时间内一个分子在流动相流动相中中出现的几率，也可以表示出现的几率，也可以