在生物个体发育的不同阶段,或是在不同的组织或细胞中发

1、第四节第四节 基因差异表达获得目的基因基因差异表达获得目的基因差异显示差异显示PCRPCR（DDRT-PCRDDRT-PCR）（1）3 锚定引物锚定引物Oligo（dTMN）：）：Oligo（dT）引物的引物的3端加两个核苷酸（倒端加两个核苷酸（倒数第二个不再是数第二个不再是T）。）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 利用利用mRNA的的poly A尾巴设计尾巴设计 利用利用两组特殊的引物两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增对差别表达的基因进行扩增12种锚定引物AG TTTTTTTT5 3 CG T

2、TTTTTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTTTTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 （2）5端的随机引物 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTT5 3 RTNM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并PCR（3）用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增12种锚定引物，若与种锚

3、定引物，若与20种随机引物，可种随机引物，可组成组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：实验结果：实验结果：如果每条带相当于一种如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出在测序胶上，每组扩出50-100条长度为条长度为100-500bp的带。的带。240组能分出组能分出20000多条带！多条带！（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较相同引物对在不同来源相同引物对在不同来源cDNA中的中的PCR产物并排电泳产物并排电泳选择有差异的带，回收测序，得到部分选择有差异的带，回收测序，得到部分c

4、DNA序列。序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。或基因。优点：优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；少等；缺点：缺点：假阳性率高、获得的假阳性率高、获得的cDNAcDNA片段很短。片段很短。1976年年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的提出了用化学方法合成基因的设想，并于设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。一、化学合成目前常用的方法一、化学合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸

5、二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、固相合成法、自动化合成法。自动化合成法。第五节第五节 基因的化学合成基因的化学合成1、互补延伸连接法二、化学合成二、化学合成DNA片断的组装片断的组装预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完聚合酶延伸成完整的双链。整的双链。3 5 5 3 Klenow片段片段引物引物5 3 T4DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶（3）T4 DNA连接酶连接酶连接连接T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶完整的完整的DNA双

6、链双链2、互补连接法、互补连接法（合成的（合成的DNA单链的单链的5端是端是-OH）（2）5端磷酸化端磷酸化（1）互补配对）互补配对预先设计合成的片断之间都有互预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。域能形成有断点的完整双链。1.全基因化学合成全基因化学合成2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难操作的含量很低，很难操作cDNA 3. 合成探针序列合成探针序列4. 定点突变合成定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低三、三、 化学合成的应用化学合成的应用DNA合成仪5. 合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点的含有各种酶切位点的人工接头（人工接头（Adaptor）或或衔接物（衔接物（Linker）序列。序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor本章重