第3、4、5次课生化天然产物化学(实验技术)

1、 提取基础 分离 白桦酸酯 合成（化学、生物转化）第三讲 天然药物活性成分的提取与分离 重要性：天然药物的开发（WTO，知识产权）一、提取1 文献2 系统预试化学成分种类3 提取溶剂（根据目的成分选择） 水（鞣质、糖类、蛋白质） 冷水、热水 HCl、NaOH 成盐溶出 醇 （乙醇、甲醇） 95% alkaloids 60-70% 皂苷、黄酮苷 40-50% 强心苷 丙酮、乙酸乙酯、氯仿等（苷元）4 提取方法（根据提取目的、要求和条件选择）冷浸法（3-4次） 渗漉法：热不稳定物、可按极性梯度提取煎煮法（3-4次）回流提取（3-4次）连续回流提取法超临界流体萃取超声波提取微波提取二、分离 1 分类

2、 粗分（部位分离） 细分（部位分组） 单离（单体成分分离）粗粗分分细细分分 2 方法 色谱法（平面色谱、柱色谱、逆流色谱） 结晶平面色谱平面色谱l 薄层色谱TLC (Thin Layer Chromatograph) 功能：定性分析（预试、指导分离) 对照标准品 种类：硅胶G, GF254 、RP-18 、聚酰胺 显色：通用碘、H2SO4/EtOH 专属alkaloids, flavonoids硅胶H-不含粘合剂；硅胶G-含煅石膏粘合剂；硅胶HF254-含荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；硅胶GF254-既含煅石膏又含荧光剂. l 实例：紫杉醇和三尖杉宁碱分离中的跟踪检测 展开

3、剂：二氯甲烷正己烷甲醇三乙胺（3.5:4.5:0.5:1）NHOOOOHOOOOHOOOHOOOHl 注意事项： 多元展开剂不能反复使用，须即配即用； 严格控制组分比例； 预饱和10min，减少边缘效应l制备薄层色谱PTLC（Preparative TLC） 功能：制备（ 达g 级） 1、吸附剂（adsorbents） 材料：Silica gel 尺寸：20*20, 20*40 cm 厚度：0.5-2 mm 2、样品带 手工、自动点样器 样品带宽的解决方法：用极性流动相展开约2cm，使带变窄用带浓缩带的板子3、流动相选择 三角形法则4、样品的收集洗脱 显色：定位 转移 洗脱 5、PTLC制备样

4、品时引入的杂质 粘合剂 杂质 指示剂 Other (分解物) (Al2O3 作吸附剂) 解决办法：Sephedex LH-20 6、TLC技术的发展HPTLC巨形板TLC 不锈钢板 (60*60 cm) ；厚度：5 mm 上样量 10 g带浓缩带TLC二维TLC 多次展开（同方向） 双向展开l加压薄层色谱OPLC（Overpressure Layer Chromatography） 又称 Overpressure TLC (OPTLC) 1、简介 1979年，HPTLC 吸收HPLC的某些特点： 平面、细颗粒、蒸气相、恒流速 2、特点 与传统PTLC比较 效率 50 mg0.5 g ；1 h3

5、、制备型OPLC 联机检测、分段收集4、应用 氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等l 离心薄层层析（CTLC） centrifugal Thin Layer Chromatogram1、概述 CTLC是在TLC和柱色谱基础上发展起来，利用旋转离心力，连续洗脱。2、仪器 倾斜盘、流动相中央进入 梯度、UV检测、N2保护 固定相活化、反复使用3、特点（1）分离快速（30min）（2）流动相少（3）进样量大（4）可梯度洗脱（5）直接检测，接收灵活（6）色谱板可反复使用（7）操作简单，占地小，移动方便柱柱 色色 谱谱Column Chromatogrphyl 常压柱色谱常压柱色谱 (0.150 g) （O

6、rdinary Column Chromatogr.） 吸附柱色谱 分配柱色谱 植物有效 柱色谱 离子交换柱色谱 成分分离 凝胶过滤柱色谱 主要手段 聚酰胺柱色谱 大孔吸附树脂一、吸附性色谱一、吸附性色谱 Al2O3 or Silica gel 生物碱 水溶性 Al2O3 甾体 脂溶性 Silica gel 挥发油 脂溶性 1 装柱装柱 Al2O3：吸附剂 : 样品 (2050 : 1) (20100 :1) Silica：吸附剂 : 样品 (30100 : 1) (300400 :1) 1) 干法 与TLC吻合度较好，溶剂消耗少 2) 湿法 紧密，前沿整齐2 上样上样 1) 湿法：溶剂溶解上

7、样（少量），低极性 2) 干法：低极性溶剂溶解性差3 洗脱洗脱 常压、低压、梯度洗脱4 收集与检查收集与检查 等份 TLC、 UV二、聚酰胺（二、聚酰胺（Polyamide）1 原理原理（1）氢键吸附原理）氢键吸附原理：基于酰胺键 酚类、酸类、醌类、硝基化合物 成氢键能力与溶剂有关 水甲醇乙醇丙酮稀氨液0.2 预纯化操作 四、闪式柱色谱四、闪式柱色谱 （Flash Chromatography) 20世纪70年代后发展起来的一种快速柱色谱技术。1 简介简介柱短，分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（Flash Sicica gel）进口，国产（山东即墨化学试剂厂）球型微粒，粒度在40-63m（

8、230-400目）之间（均匀）加压色谱 0.3-1 Kg/cm210 mg-10 g 样品10-15 min2 操作操作 与普通柱色谱法基本相同。装柱：湿法 干法（20 cm）上样：拌样 湿法洗脱：Rf 0.2-0.3 加液8-10 cm，加压3 实际应用实际应用 皂苷、甾体、生物碱、黄酮 五、棒色谱五、棒色谱 （Stick Chromatography)1 简介简介 与制备型薄层色谱原理相同,分离量大。把硅胶、氧化铝等制成园柱形的棒，下端上样，上行展开而达到分离目的。2 操作操作 l 制棒l 上样l 展开 引导座两端相通，内填层析硅胶 展开装置层析槽，密封罩l 收集3 3 应用应用 生物碱、

9、皂苷、甾醇等l 加压柱色谱加压柱色谱 （Pressure Liquid Chromatogr.）类型类型 低压柱色谱 加压柱层析 中压柱色谱 高压柱色谱优点优点 分离因子 a 高，故能完成复杂的分离过程 （ a =两组分的相对保留时间之比，分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标） 制备型与分析型的区别：制备型与分析型的区别： 分析型：不要求样品回收 制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的层析 装置和操作系统 基本原理基本原理 1 加压柱色谱效果 Speed 分析型 制备型 Resolution Load 与与Load相关的因素相关的因素 柱径、柱长、粒度、填充剂密度 2 加压柱色谱目的加压柱

10、色谱目的 得到单体化合物 Lab. 一定纯度 生产规模 回收率 单位时间内分得的化合物量 洗脱液流速快 可用更细的颗粒，分辨率提高 避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解（最大优点） 3 分类（分类（Classifcaton） Analytical HPLC: g 5mg Prep. HPLC: 5 mg 1 g Low-pressure LC: 10 mg 1 g Medium-pressure LC: 100 mg 100 g 选择制备型系统需要考虑选择制备型系统需要考虑：以上各法的极限（适应范围）根据以上条件要求而选用的方法上样量：质量超载（少量样品）or体积超载（多量样品）

11、柱尺寸，固定相粒度，压力，洗脱剂经验积累4 操作操作TLC探索条件（色谱系统选择）分析型小试优化条件（超载）套用优化条件（制备）正式操作获得纯品分析鉴定纯品再生柱：5倍柱体积 正相：actonewatermethanolTHF dichloromethane 反相：watermethanol5 Prep. LC的各种条件的应用情况及优化的各种条件的应用情况及优化（1）Column: loading, f, size, column efficiency, a, K number of theoretical plates, resolution（2）Stationary phase: 固液、粒

12、度大小硅胶 普通、键合相 AgNO3coated silica gel 涂层AgNO3 分离萜类分开不同双键数目或位置Paired-ion Chromatogr. 生物碱 在柱上增加一种离子，该离子与欲分离物相反， 从而成为离子对，而成中性，易分离Chiral stationary phase（3）装柱技术 加样法（Sample introduction） 加压泵（Pump） 检测器（Detectors） 流动相（Eluent） 分离样品收集 切割与再循环技术 二个成分色带太近，超出层析灵敏度范围，分不开时，采取的方法。（样品通过检测器不受破坏） 柱超载及中心切割法 要想得量多，需超载，要用中心切割法纯化，注意检测器峰值。一、低压柱色谱一、低压柱色谱 （Low-pressure LC）1 简介简介 低压柱色谱可以用玻璃自制，现绝大多数是购买预制柱。 长度：从240 mm440 mm 内径：从10 mm37 mm 外径：从13 mm42 mm L ID OD 进样量 A 240 10 13 0.3-1ml 0.2g B 310 25 28 1-5ml 1g C 440 37 42 2-10ml 3g2 操作操作 填充剂：40-60m，与TLC相同，流速快 加压：氮气瓶 约5bar 机