细菌发酵制药

1、LOGOEdit your company slogan学习情境一学习情境一细菌发酵制药细菌发酵制药发发 酵酵 制制 药药LOGOEdit your company slogan子学习情境子学习情境1.1天冬酰胺酶发酵天冬酰胺酶发酵LOGO天冬酰胺酶生产的工艺流程天冬酰胺酶生产的工艺流程 LOGO任务任务1 1 菌种保藏菌种保藏任务任务2 菌种复壮菌种复壮任务任务3 种子扩大培养种子扩大培养任务任务4 发酵罐的使用和维护发酵罐的使用和维护任务任务5 发酵控制、分离纯化及活性测定发酵控制、分离纯化及活性测定子学习情境子学习情境1 天冬酰胺酶发酵天冬酰胺酶发酵LOGO任务任务1 1 菌种保藏菌种保

2、藏LOGO一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的 保持菌种的存活率与优良遗传性状保持菌种的存活率与优良遗传性状 ； 防止菌种退化与污染 使已经退化的菌种恢复原有的性状 总之，就是防止优良遗传性状的丧失和菌种死亡。 LOGO二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 挑选典型培养物（挑选典型培养物（typical culturetypical culture）的优良纯种，）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。生长受抑制的休眠状态。 菌种的保藏主要是依据微生物的生理、生化特性，人工创造条件使微生物代谢

3、活动处于不活泼状态。利用微生物的孢子、芽孢及营养体，给以不适合其萌发、生长、繁殖的条件，即低温、干燥、缺氧、缺营养等手段来达到菌种保藏的目的。 LOGO三、菌种的保藏方法三、菌种的保藏方法 斜面保藏法 沙土保藏法 冷冻真空干燥保藏法 试管熔封保藏法 矿油保存法 LOGO（一）斜面保藏法（一）斜面保藏法 1、贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面正上方。 2、接种：将待藏菌种用些面接种法移种至标明菌名的相应试管斜面上。 3、培养：细菌置37恒温培养1524h，酵母菌置2830恒温培养3660h，放线菌和丝状真菌置28培养47d。 4、收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎

4、或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4冰箱保存。保存温度不宜太低，否则会因结冰脱水而加速菌种的死亡。斜面菌种LOGO（二）沙土管或硅胶管保藏法（二）沙土管或硅胶管保藏法1、处理沙土：取河沙经60目筛子过筛以除去大的颗粒，用10%HCL浸泡（用量以浸没沙面为度）24h（或煮沸30min）以除去有机质，然后倒去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干或晒干备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干、粉碎，用100120目的筛子过筛备用。2、装沙土管：将沙与土按2：1或4：1（W/W）比例混合均匀，装入试管（10mm100 mm）中，装置约1cm高，加棉塞后用高压蒸汽灭菌（121灭菌30min）。灭菌后取少许置于牛肉

5、膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在合适的温度下培养一段时间确证无菌生长才能使用。3、制备菌液：吸3ml无菌水至斜面菌种管内，用接种环轻轻搅动，洗一下孢子制成孢子悬液。4、加孢子液：吸取上述孢子液0.10.5ml于每一沙土管中，加入量以湿润沙土达2/3高度为宜。5、干燥：将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5（或变色硅胶）做干燥剂，再用真空泵抽气24h以加速干燥。6、收藏：沙土管可选择下列方法之一。保藏于干燥器中。将沙土管取出，管口用火焰熔封后保藏。将沙土管装入含CaCl2等干燥剂的大试管内，塞上橡皮塞并用蜡封管口，置于4冰箱中保藏。7、恢复培养：使用时挑少量混有孢子的沙土接种于斜面培

6、养基上即可。沙土管仍可原法继续保藏。LOGO（三）冷冻真空干燥保藏法（三）冷冻真空干燥保藏法分支管再与麦氏真空计和冷凝管相连。冷凝管的另一端连接在真空泵上。置冷凝管于盛有干冰（固体CO2）的广口保温瓶中，使安瓿管中抽出的水汽进入冷凝管内立刻冻结。将安瓿管的下半部也埋入干冰中，使管内物质骤然冷却。约10min，管内物质已全部冻结，开动真空泵30min后，将安瓿管移入-15的冰盐水中，继续开动真空泵抽气1h，然后将安瓿管置于室温中，再抽气30min。此时管内物质已全部干燥，样品呈疏松状。用微型煤气灯在真空状态下，熔封安瓿管的颈部。将制好的冷冻菌种管置于4冰箱中保藏。 先将牛奶煮沸后冷却，去掉上面的

7、一层脂肪。反复三次后用脱脂棉过滤，或者将牛奶在3000r/min的离心机中离心数分钟，除去表面脂肪后，在50kPa压力下灭菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上长好的菌体，制成菌悬液，装入安瓿管中约0.1ml，塞上棉塞，用橡皮管将安瓿管连接在分支管上（见图1-1）图1-1 冷冻干燥封管装置简图1、安瓿管 2、干冰容器 3、接真空计 4、接真空泵 5、冷凝管LOGO（四）试管熔封（密封）保藏法（四）试管熔封（密封）保藏法试管熔封法的一般操作如下：用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养2448小时后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。使用时，用砂轮在

8、管口划一圈，并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上，由于试管经熔封后，可防止培养基水分蒸发，又可减缓细菌的代谢速度，并能防止杂菌污染。密封法保藏法将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基（细菌采用肉汤琼脂、酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏号培养基）上，经适温培养后，（细菌d，孢芽菌、放线菌d，酵母菌d）塞紧棉花塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空泵相连接，开动真空泵抽真空30rain至h（此时真空度约为640），关闭密封口，拔出胶塞，置于室温下保存，待使用时，打开盖，取出菌种，接种至培养基上即可 。LOGO（五）矿油保存法（五）矿油保存法 菌种在琼脂斜面上

9、或在半固体琼脂试管中生长后，在试管中再加入无菌液体石蜡，使覆盖在培养基上面，这样就使菌种和培养基与外界空气隔绝，并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封口，放置低温保存，至少可以保存六个月至一年）。 LOGO表表1-1 菌种保藏各种方法比较表菌种保藏各种方法比较表LOGO表表1-2微生物菌种制备、保藏和使用记录表微生物菌种制备、保藏和使用记录表LOGO表表1-3 菌种接收记录表菌种接收记录表LOGO任务任务2菌种复壮菌种复壮LOGO菌种合理传代方法之一菌种合理传代方法之一LOGO一、菌种的衰退、复壮概念一、菌种的衰退、复壮概念1.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由

10、于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。2、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用

11、自发突变（正变）不断地从生产中选种。 LOGO二、菌种复壮的主要方法二、菌种复壮的主要方法 纯种分离法 宿主体内复壮法 淘汰法 遗传育种法 菌种保藏方法 LOGO纯种分离法纯种分离法平板表面涂布法平板表面涂布法平板划线分离法平板划线分离法琼脂培养基浇注法琼脂培养基浇注法用用“分离小室分离小室”进行单细胞分离进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用显微操纵器进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离用菌丝尖端切割法进行单细胞分离菌落纯菌落纯（菌种纯）（菌种纯）细胞纯细胞纯（菌株纯）（菌株纯）纯种分离法纯种分离法LOGO平板涂布方法LOGO平板划线方法平板划线方法LOGO三、菌种复壮操作步骤三

12、、菌种复壮操作步骤1、菌悬液的制备。用无菌生理盐水或缓冲液将斜面菌体洗下制成菌悬液。经一定浓度稀释后在平板上进行菌落计数。 2、平板分离。根据计数结果，定量稀释后制成菌浓度为每毫升50-200个的菌悬液，取0.1毫升注入平皿，再倒入适量培养基，摇匀，制成混菌平板，培养后长出 分离的单菌落。3、纯培养。选取分离培养后长出的各型单菌落，接种斜面后培养。4、初筛。将成熟的斜面菌种对应接入发酵瓶，摇床发酵一段时间后测定各菌落生产性能。5、复筛。挑选初筛中高单位菌株的5%20%进行摇瓶复试，最好使用母瓶与发酵瓶二级发酵，重复35次后分析确定产量水平。初、复筛都需以正常生产菌种作对照，复筛出的菌株产量应比

13、对照菌株提高5%以上，并经糖、氨代谢检验，合格后在生产罐上试验。 6、菌种保藏。将复筛后得到的高单位菌株制成沙土管、冷冻管或用其他方法保藏。LOGO任务任务3 种子扩大培养种子扩大培养LOGO 种子扩大培养种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持

14、稳定的生产能力。 LOGO一、种子的制备过程一、种子的制备过程种子扩大培养流程图LOGO1、实验室细菌种子的制备、实验室细菌种子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。 (1)菌种培养：采取大肠杆菌ASl-375。普通牛肉培养基，接种后于37培养24h。(2)种子培养。16%玉米浆，接种量1%一1.5%，37温度，通气搅拌培养48h。 其过程如下： 试管三角瓶摇床种子罐 LOGO液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）LOGO2、生产车间种子制备、生产车间种子制

15、备 种子罐的作用： 主要是使菌体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 种子罐级数的确定 种子罐级数种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： 菌种生长特性、菌体繁殖速度； 所采用发酵罐的容积。 细菌细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 LOGO3、确定种子罐级数需注意的问题、确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子

16、发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 LOGO二、种子质量的控制二、种子质量的控制 (一一)影响孢子质量的因素及控制影响孢子质量的因素及控制 影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。间和冷藏时间等。 1 、培养基培养基 （1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用； （2）严格控制灭菌后培养基的质量；）严格控制灭菌后培养基的质量； （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间； （4）供生产用的孢子培养基要用比

17、较单一的氮源，作为）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。 LOGO2、种龄与接种量、种龄与接种量 种龄种龄：种子培养时间。 一般选择对数期，缩短发酵周期。 接种量接种量：移入的种子液体积与接种后培养液体积比。 多数抗生素的接种量在7%-15%，有时20-25%。依据具 体的发酵类型和工艺条件而定。3、温度：、温度： 温度直接影响生长和酶的合成；最适温度最适温度。LOGO 4、pH值：对微生物有明显的影响各种微生物都有生长的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。调节方法调节方法 (1) 酸

18、碱溶液中和 (2) 缓冲溶液 (3) 生理缓冲剂LOGO 5、通气搅拌搅拌：搅拌： 促进氧的溶解，营养物质与代谢产物的分散。 通气：通气： 通气量的多少以溶解氧溶解氧来衡定。LOGO 6、泡沫危害危害： 影响微生物对氧的吸收。消泡方法：（1） 消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；（2） 机械消泡：（3）改变培养基成分。LOGO 7、染菌的控制 染菌原因染菌原因： 设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭灭菌不彻底菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严无菌操作不严、菌种不纯； 8、种子罐级数 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌。LOGO任

19、务任务4 发酵罐的使用和维护发酵罐的使用和维护LOGO一、发酵罐的结构一、发酵罐的结构1、空气预处理器 2、电动阀 3、电磁流量计 4、空气预滤器 5、空气精滤器 6、蒸汽过滤器 7、pH 电极 8、电动阀（夹套进冷水） 9、电动阀（夹套进热水） 10、通风管 11、消沫电极 12、消沫器 13、搅拌器 14、检测温度的电热偶 15、DO电极 16挡板 17电机 18、减速器 19、接种孔 20、出水阀 21、夹套 22、冷凝水排除阀 23、取样与放料阀（三向阀门）图1-6 100L全自动实验罐结构示意图LOGO二、发酵罐的使用二、发酵罐的使用 （一）空气过滤器的灭菌操作 1、灭菌前的准备 启

20、动蒸汽发生器 将自来水引入水处理装置进行除杂、软化处理，处理后留入贮水灌，然后开启自动控制开关进行加热，蒸汽压力达到0.2-0.3Mpa时可供使用。 启动冷冻机 将自来水引入冷冻机，开启冷水机电源开关制冷。当冷水温度达到10时，可供空气预处理使用。 启动空气压缩机 启动前，先关闭空气管路上所有阀门，然后打开空气压缩机电源开关，启动空气压缩机。当空气压缩机的压力达到0.25Mpa左右时，依次打开管路上阀门，将空气引入冷冻机、油水分离器，经过冷却、除油水后进入贮气罐，待用。LOGO2、空气过滤器的灭菌、吹干以及保压、空气过滤器的灭菌、吹干以及保压图1-7是100L发酵罐空气管道示意图1、电动阀 2

21、、电磁流量计 3、粗滤器 4、空气阀门 5、排气阀1 6、压力表 7、精滤器 8、排气阀2 9、空气阀门 10、排气阀311、蒸汽阀1 12、空气过滤器 13、蒸汽阀2 14排气阀4LOGO（二）发酵罐的空消（二）发酵罐的空消 发酵罐空消前，必须首先检查并关闭发酵罐夹套的进水阀门，然后启动计算机，按照操作程序进入到显示发酵罐温度的界面，以便观察温度变化。 空消时，先打开夹套的冷凝水排出阀，以便夹套中残留的水排出，然后从两路管道将蒸汽引入发酵罐：一路是发酵罐的通风管，另一路是发酵罐的放料管。每一路进蒸汽时，都是按照“由远处到近处”依次打开各个阀门。两路蒸汽都进入发酵罐后，适当打开所有能够排汽的阀

22、门充分排汽，如管路上的小排汽阀、取样阀、发酵罐的排气阀等，以便消除灭菌的死角。灭菌过程中，密切注意发酵罐温度以及压力的变化情况，及时调节各个进蒸汽阀门以及各个排汽阀门的开度，确保灭菌温度在（1211），维持30min，即可达到灭菌效果。灭菌完毕，先关闭各个小排汽阀，然后按照“由近处到远处”依次关闭两路管道上各个阀门。待罐压降至0.05Mpa左右时，关闭发酵罐的排气阀，迅速打开精过滤器后的空气阀，将无菌空气引入发酵罐，利用无菌空气压力将管内的冷凝水从放料阀排出。最后，关闭放料阀，适当打开发酵罐的排气阀，并调节进空气阀门开度，使罐压维持在0.1Mpa左右，保压，备用。LOGO（三）培养基的实消（三

23、）培养基的实消 培养基实消前，关闭进空气阀门并打开发酵罐的排气阀，排出发酵罐内空气，使罐压为0，再次检查并关闭发酵罐夹套的进水阀门、发酵罐放料阀。将事先校正好的pH电极、DO电极以及消沫电极等插进发酵罐，并密封、固定好。然后，拧开接种孔的不锈钢塞，将配制好的培养基从接种孔倒入发酵罐。启动计算机，按照操作程序进入到显示温度、pH、DO、转速等参数的界面，以便观察各种参数的变化。同时，启动搅拌，调节转速为100r/min左右。 LOGO 实消时，先打开夹套的进蒸汽阀以及冷凝水排出阀，利用夹套蒸汽间接加热，至80左右，为了节约蒸汽，可关闭夹套的进蒸汽阀，但必须保留冷凝水排出阀处于打开状态。然后，按照

24、空消的操作，从通风管和放料管两路进蒸汽直接加热培养基。实消过程中，所有能够排汽的阀门应适当打开并充分排汽，根据温度变化及时调节各个进蒸汽阀门以及各个排汽阀门的开度，确保灭菌温度和灭菌时间达到灭菌要求（不同培养基灭菌要求不一样）。 LOGO 灭菌完毕，先关闭各个小排汽阀，然后关闭放料阀，并按照“由近处到远处”依次关闭两路管道上各个阀门。待罐压降至0.05Mpa左右时，迅速打开精过滤器后的空气阀，将无菌空气引入发酵罐，调节进空气阀门以及发酵罐排气阀的开度，使罐压维持在0.1Mpa左右，进行保压。最后，关闭夹套冷凝水排除阀，打开夹套进冷却水阀门以及夹套出水阀，进冷却水降温，这时，启动冷却水降温自动控

25、制，当温度降低至设定值机自动停止进水。自始至终，搅拌转速保持为100r/min左右，无菌空气保压为0.1Mpa左右，降温完毕，备用。LOGO（四）接种操作（四）接种操作 接种前，调节进空气阀门以及发酵罐排气阀门的开度，使罐压为0.01-0.02Mpa。 用酒精棉球围绕接种孔并点燃。在酒精火焰区域内，用铁钳拧开接种孔的不锈钢塞，同时，迅速解开摇瓶种子的纱布，将种子液倒入发酵罐内。 接种后，用铁钳去不锈钢塞在火焰上灼烧片刻，然后迅速盖在接种孔上并拧紧。 最后，将发酵罐的进气以及排气的手动阀门开大，在计算机上设定发酵初始通气量以及罐压，通过电动阀门控制发酵通气量以及罐压，使达到控制要求。 LOGO（

26、五）发酵过程的操作（五）发酵过程的操作参数控制 发酵过程中在线检测参数可通过计算机显示，通气量、pH、温度、搅拌转速和罐压等许多参数，可按照控制软件的操作程序进行设定，只要调解机构在线，通过计算机控制调解机构而实现在线控制。 流加控制 流加时，在火焰区域内揭开不锈钢插针的包扎，并将插针迅速插穿流加孔的硅胶塞，同时，将硅胶罐装入蠕动泵的挤压轮中，启动蠕动泵，积压轮转动可以将流加液压进发酵罐。通过计算机可以设定开始流加的时间、挤压轮的转速，从而可以自动流加以及自动控制流加速度。 取样操作 取样时，可调节罐底的三向阀门至取样位置，利用发酵罐内压力排出发酵液，用试管或烧杯接收。取样完毕，关闭三向阀门，

27、打开与之连接的蒸汽，对取样口灭菌几分钟。放料操作 发酵结束后，先停止搅拌，然后，关闭发酵罐的排气阀门，调节罐底的三向阀门至放料位置，利用发酵罐内压力排出发酵液，用容器接受发酵液。LOGO（六）发酵罐的清洗与维护（六）发酵罐的清洗与维护 放料结束后，先关闭放料阀以及发酵罐进空气阀门，打开排气阀门派出馆内空气，使罐压为0。然后，拆卸安装在罐上的pH、DO等电极以及流加孔上的不锈钢插针，并在电极插空和流加孔拧上不锈钢塞。接着，从接种孔加入70L左右的清水，启动搅拌，转速为100r/min左右，用蒸汽加热清水至121左右，搅拌30min左右，以此清洗发酵罐。清洗完毕，利用空气压力排出洗水，并用空气吹干

28、发酵罐。 停用蒸汽时，切断蒸汽发生器的电源，通过发酵罐的各个蒸汽管道的排气阀排出残余蒸汽，直至蒸汽发生器上的压力表现是为0。停用空气时，切断空气压缩机的电源，通过空气管道的排气阀排出残余空气，直至贮气罐上压力表显示为0。最后，关闭所有的阀门以及计算机。LOGO（七）电极的使用与维护（七）电极的使用与维护pH电极的使用与维护 在pH电机装上发酵罐之前，须对pH电极进行两点校正。pH电极与计算机连接后接通电源，将pH电极分别浸泡在两种不同pH的标准缓冲溶液中进行校正，检查测定值的两点斜率，一般要求斜率90%，方可使用。 DO的电极的使用与维护 使用前，DO电极与计算机连接并接通电源，将DO电极浸泡

29、在饱和的亚硫酸钠溶液中（或培养基恒温结束降温前），此时的测量指标定为0。发酵培养基灭菌并冷却至初始发酵温度充分通风搅拌（一般以发酵过程的最大通风和搅拌转速条件下氧饱和）时，DO电极的测量指标定为100%。LOGO（八）折叠膜过滤芯的维护（八）折叠膜过滤芯的维护 折叠膜过滤芯，其锁扣、外筒、端盖以及密封胶圈虽然都是热稳定材料，但耐高温有一定限度。灭菌时，必须严格控制灭菌温度和灭菌时间，若灭菌温度过高、灭菌时间过长，容易造成损坏。同时，灭菌后必须用空气吹干，才能使用，否则过滤效率降低或失效。不使用时，必须保持干燥，以免霉腐。 LOGO（九）蒸汽发生器的维护（九）蒸汽发生器的维护 用于蒸汽发生器的水必须经过软化、除杂等处理，以免蒸汽发生器加热管结垢，影响产生蒸汽的