基因工程原理和技术

1、基因工程原理和技术第二节 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术一、教学目标：一、教学目标：1.了解基因工程的基本原理。了解基因工程的基本原理。2.描述重组描述重组DNA技术的基本步骤。技术的基本步骤。二、教学重点、难点：二、教学重点、难点：基因工程的基本原理和基本操作步骤。基因工程的基本原理和基本操作步骤。一、基因工程的原理和操作步骤：一、基因工程的原理和操作步骤： 原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。宿主细胞中稳定和高效表达。 目的基因的获取；目的基因的获取； 形成重组形成重组DNA分子；分子； 重组重组DNA 导入受体细

2、胞；导入受体细胞； 筛选含有目的基因的受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞； 目的基因表达。目的基因表达。二、基因工程操作步骤：二、基因工程操作步骤：1.第一步：目的基因的获取第一步：目的基因的获取（1）方法：）方法： 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用聚合酶链式反应利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的技术扩增目的基因（目的基因的序列已知）基因（目的基因的序列已知） 化学方法合成目的基因（目的基因的序列化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知）已知） 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因基因文库。基因文库。 利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚

3、合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。循环循环变性变性退火退火延伸延伸目的基因目的基因的扩增呈的扩增呈指数形式指数形式扩增（扩增（2n）化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因化学方法合成目的基因2 2、形成重组形成重组DNA分子分子 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个粘性末端两个

4、粘性末端3 3、将重组、将重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞转化转化 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（1 1）将重组）将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法（2 2）将重组）将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植1.1.将重组将重组DNADNA导入植物细胞导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转

5、化法基因枪法基因枪法2.2.将重组将重组DNADNA导入动物细胞导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将重组将重组DNADNA导入微生物细胞导入微生物细胞Ca2+处理，处理，以增加细菌细胞壁的通透性。以增加细菌细胞壁的通透性。抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A A，只有少数导入的是重

6、组质粒。，只有少数导入的是重组质粒。四环素抗性基因四环素抗性基因怎样筛选出已经导入质粒的细胞？怎样筛选出已经导入质粒的细胞？4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点四环素抗性基因四环素抗性基因在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点四环素抗性基因四环素抗性基因图图a a示基因工程中经常选用的载体示基因工程中经常选用的载体pBR322pBR322质粒，质粒，AmpAm

7、pr r表示氨苄青霉素抗性基表示氨苄青霉素抗性基因，因，TetTetr r表示四环素抗性基因。目的基因如表示四环素抗性基因。目的基因如果插入果插入四环素抗性四环素抗性基因中，将使该基因失活，基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。而不再具有相应的抗性。abAmprTetrc再将灭菌绒布按到图再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得按到含四环素的培养基上培养，得到如图到如图c的结果（空圈表示与的结果（空圈表示与b对照无菌对照无菌落的位置）。落的位置）。 为了检查载体是否导入原本没有为了检查载体

8、是否导入原本没有Ampr 和和Tetr的大肠杆菌，将大肠的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图上，得到如图b的结果（黑点表示的结果（黑点表示菌落）。菌落）。原理：质粒上有抗生素的抗性基因原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选方法：利用选择培养基筛选检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了上是否插入了目的基因（关键）目的基因（关键）检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：）常用的技术：DNA分子杂交技术

9、分子杂交技术蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交5. 目的基因的表达目的基因的表达（1）内容：）内容：分子水平：分子水平：DNA分子杂交技术分子杂交技术核心核心DNA探针探针目的基因的脱氧核苷酸目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段（单链）序列片段用荧光分子或放射性同用荧光分子或放射性同位素标记位素标记看能否形看能否形成杂合的成杂合的双链区双链区检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白

10、质抗虫鉴定、抗病鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定等过程过程:A.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段( 单链单链)用放射性同位素等作标记用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中方法方法: : DNADNA分子杂交分子杂交方法方法: : 分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂

11、若出现杂交带交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA.基因工程的基本操作程序目的基因的获取目的基因的获取形成重组形成重组DNADNA分子分子将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、抗原分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分

12、子检测外的个体水平鉴定本节小结：1. 用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是白质。下列叙述不正确的是 A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒质粒 B.DNA连接酶和连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶粒必需的工具酶 C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒否导入了重组质粒 D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达达 B巩固练习巩固练习2下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取

13、目的基因的方法的是( )利用利用mRNA反转录形成反转录形成 从基因文库中提取从基因文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCR技术技术 利用利用DNA转录转录 人工合成人工合成A B CDD3.基因工程又叫基因拼接技术。基因工程又叫基因拼接技术。 (1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的以目的基因转录的 为模板，为模板， 成互补的单链成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成 。 (2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、 。 (3)

14、假设以大肠杆菌质粒作为载体，并以同一种限制性内切假设以大肠杆菌质粒作为载体，并以同一种限制性内切酶切割载体与目的基因，将切割后的载体与目的基因片酶切割载体与目的基因，将切割后的载体与目的基因片段混合，并加入段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有连接酶。连接产物至少有 种环状种环状DNA分子，它们分别分子，它们分别 是是 。信使信使RNA 逆转录逆转录 双链双链DNA(目的基因目的基因)动植物细胞动植物细胞 3 载体自连的、目的基因片段自连的、载体自连的、目的基因片段自连的、载体与目的基因片段相连的环状载体与目的基因片段相连的环状DNA分子分子 目的基因与质粒的连接目的基因与质粒的连接 基因

15、基因DNADNA文库的构建文库的构建 将总将总DNADNA经过酶解，分离不同长短的经过酶解，分离不同长短的DNADNA片段。包含的片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单链分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在

16、一起，形成杂合双链区；在没有互补碱的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交探针）与目的基因杂交，有无杂交带带 传统的遗传育种方法有哪些？ 传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？ 基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种二、基因工程与疾病治疗二、基因工程与疾病治疗（）基因工程药物（）基因工程药物（2 2）基因诊断）基因诊断（3

17、3）基因治疗）基因治疗三、三、 基因工程与环境保护基因工程与环境保护基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种一、基因工程与作物育种1.抗虫转基因植物抗虫转基因植物2.抗病转基因植物抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）4.利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质基因工程在农业上的应用：基因工程在农业上的应用：1 1）高产、稳产和具优良品质的品种）高产、稳产和具优良品质的品种2 2）抗逆性品种）抗逆性品种基因工程与疾病治疗基因工程与疾病治疗v 基因工程药品的生产基因工程胰岛素基因工程胰岛素 胰岛素是

18、治疗糖尿病的胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺胰腺只能提取只能提取4-5g4-5g的胰岛素，的胰岛素，其产量之低和价格之高可想其产量之低和价格之高可想而知。而知。基因工程胰岛素基因工程胰岛素 将合成的胰岛素基因导入大将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每肠杆菌，每2000L2000L培养液培养液就能产生就能产生100g100g胰岛素！胰岛素！大规模工业化生产不但大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使的药品产量问题，还使其价格降低了其价格降低了30%-50%!30%-50%!基因工程干扰素基因工程干扰素 干扰素治疗病毒感染简直是干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药万能灵药”！过去从人血中提取，过去从人血中提取，300L3