生物光子学502

1、主讲人：刘立新西安电子科技大学1第第 5 章章生物光子学成像技术生物光子学成像技术2 物镜：物镜： 在显微镜中，在显微镜中，物镜的作用是将样品做第一次放大物镜的作用是将样品做第一次放大，形，形成中间像。成中间像。 物镜是物镜是决定显微镜的像的质量、分辨率和放大倍数决定显微镜的像的质量、分辨率和放大倍数的的最关键的光学部件。最关键的光学部件。 物镜一般物镜一般由几个不同球面半径的透镜组合由几个不同球面半径的透镜组合而成，放大而成，放大倍数越高、矫正程度越高的物镜其构造愈复杂。倍数越高、矫正程度越高的物镜其构造愈复杂。5.2 光学显微技术光学显微技术3常规物镜的放大倍率等于常规物镜的放大倍率等于b

2、/a=f/z=z/fb目镜的放大倍率等于目镜的放大倍率等于250/目镜的焦距目镜的焦距总大放大倍率等于物镜与目镜放大倍率的乘积总大放大倍率等于物镜与目镜放大倍率的乘积所有物镜的使用都是有条件的，即所有物镜的使用都是有条件的，即特定的镜筒长度特定的镜筒长度5.2 光学显微技术光学显微技术4无穷远物镜的放大倍率无穷远物镜的放大倍率Tube lens的焦距和物镜焦距的比值的焦距和物镜焦距的比值ICS（infinity color-corrected system）物镜的优点：物镜的优点：物镜和筒镜之间的光是物镜和筒镜之间的光是平行光平行光，可在中间加滤光片、反光镜等而不影响成像质量，可在中间加滤光片

3、、反光镜等而不影响成像质量物镜和筒镜共同形成完全校正后的中间像，无需目镜进一步校正物镜和筒镜共同形成完全校正后的中间像，无需目镜进一步校正ICS物镜的共同点：物镜的共同点：相同的等焦面长度（相同的等焦面长度（45mm），可自由切换），可自由切换标准螺纹配合标准螺纹配合5.2 光学显微技术光学显微技术5 物镜的性能指标：物镜的性能指标： 数值孔径：数值孔径：NA=n sin （自由）工作距离（自由）工作距离 这个距离不能够小于这个距离不能够小于0.1mm。在现代物镜中，在现代物镜中，自由工作距离和物自由工作距离和物镜长度的总和被规定为一个固定的数值镜长度的总和被规定为一个固定的数值。 物镜的设计

4、原则：物镜的设计原则：较低倍数的物镜具有较少的透镜，它被做得短较低倍数的物镜具有较少的透镜，它被做得短一些，具有较长的工作距离；较高倍数的透镜具有很多透镜，它一些，具有较长的工作距离；较高倍数的透镜具有很多透镜，它被做得较长一些，相应地具有较短地工作距离。使用一组这样的被做得较长一些，相应地具有较短地工作距离。使用一组这样的物镜时，在转动物镜转换台时，只需要用细调稍微聚焦就可以得物镜时，在转动物镜转换台时，只需要用细调稍微聚焦就可以得到一个清晰的像。到一个清晰的像。5.2 光学显微技术光学显微技术6 分辨力和最小分辨距离：分辨力和最小分辨距离： 显微镜的分辨力主要由物镜的分辨力所决定；显微镜的

5、分辨力主要由物镜的分辨力所决定； 表示物镜分辨力大小的参数是最小分辨距离（一般用表示物镜分辨力大小的参数是最小分辨距离（一般用 表示），它是指物镜可以分辨的两个物点之间的最小表示），它是指物镜可以分辨的两个物点之间的最小距离。距离。NA61. 05.2 光学显微技术光学显微技术7衍射极限决定了光学显微镜的极限分辨力衍射极限决定了光学显微镜的极限分辨力, ,它和光波长它和光波长, ,数数值孔径有关。值孔径有关。分辨力和分辨率是两个概念！分辨力和分辨率是两个概念！ 浸润物镜：浸润物镜： 提高数值孔径提高数值孔径 干系、水浸、油浸干系、水浸、油浸 不能混用不能混用 标记：标记：W, OIL 数值孔径

6、越大，对光的收集能力越强，空间分辨率越数值孔径越大，对光的收集能力越强，空间分辨率越高。高。5.2 光学显微技术光学显微技术8NA=n sin 物镜的校正类型：物镜的校正类型： 物镜除了放大倍数、数值孔径和油浸系外，校正类型也物镜除了放大倍数、数值孔径和油浸系外，校正类型也很多很多 分为像差和色差的校正分为像差和色差的校正 消色差、半复消色差（消色差、半复消色差（ FL ）、复消色差（）、复消色差（ APO ）、平）、平面消色差（面消色差（ PL或或PLAN ）、平面复消色差（）、平面复消色差（ PLAN APO或或PL APO ）等五种物镜）等五种物镜5.2 光学显微技术光学显微技术9 物镜

7、的校正类型物镜的校正类型-Cont ： 消色差物镜：消色差物镜：用于一般观察，没有特殊标记。可以使两种色彩用于一般观察，没有特殊标记。可以使两种色彩（486和和656nm）的像点重合在一起。）的像点重合在一起。 半复消色差（萤石）物镜：半复消色差（萤石）物镜：标记标记FL或或Fluorite，它是由一种光学性，它是由一种光学性能不同于玻璃的矿物质萤石（能不同于玻璃的矿物质萤石（CaF2）所制成，可以很好地校正色）所制成，可以很好地校正色差，并且对球面差的校正也比消色差物镜好。常用于高倍观察和显差，并且对球面差的校正也比消色差物镜好。常用于高倍观察和显微照相。缺点：显示出一定程度的场曲率微照相。

8、缺点：显示出一定程度的场曲率 复消色差物镜：复消色差物镜：标记标记APO，它在红绿蓝三种色彩上对色差可以校正。，它在红绿蓝三种色彩上对色差可以校正。分辨率更高，价格昂贵。分辨率更高，价格昂贵。 平面消色差物镜：平面消色差物镜：标记标记PL和和PLAN，它除了具有消色差物镜的性能，它除了具有消色差物镜的性能外，最大的优点是对于场曲率能进行很好地校正外，最大的优点是对于场曲率能进行很好地校正 平面复消色差物镜：平面复消色差物镜：标记标记PLAN APO和和PL APO，它是一种可以既，它是一种可以既可以对场曲率进行校正，而且在复消色差水平上可以对色差和球面可以对场曲率进行校正，而且在复消色差水平上

9、可以对色差和球面差进行校正的透镜复合体。一般包含差进行校正的透镜复合体。一般包含815个由不同材料制成地单个由不同材料制成地单个透镜，价格非常贵。个透镜，价格非常贵。5.2 光学显微技术光学显微技术 物镜的标记物镜的标记 ： 用用颜色编码颜色编码可快速识别可快速识别物镜的放大倍率以及浸物镜的放大倍率以及浸润介质的种类润介质的种类5.2 光学显微技术光学显微技术11 物镜的标记物镜的标记 ：5.2 光学显微技术光学显微技术12 目镜目镜 ： 目镜的作用：目镜的作用：对中间像进一步对中间像进一步放大，并成像到视网膜上放大，并成像到视网膜上 1 中间像位置，放十字线中间像位置，放十字线 2 视场视场

10、 3 目镜镜头目镜镜头 4 目镜瞳孔位置目镜瞳孔位置= 眼睛瞳孔眼睛瞳孔 5 屈光度补偿的聚焦环屈光度补偿的聚焦环5.2 光学显微技术光学显微技术13 眼点：眼点： 如果在目镜的上面放置一块荧光透明物质或场玻璃，就可以看到从如果在目镜的上面放置一块荧光透明物质或场玻璃，就可以看到从目镜中射出的光束呈陀螺形。在目镜上面所出现的光线交叉点称为目镜中射出的光束呈陀螺形。在目镜上面所出现的光线交叉点称为眼点，也称为出瞳眼点，也称为出瞳。交叉点的横切面呈圆盘状，。交叉点的横切面呈圆盘状，直径通常为直径通常为1-1.5mm，在光学上它是显微镜所形成的物镜孔径的像。，在光学上它是显微镜所形成的物镜孔径的像。

11、 视场：视场： 目镜改变目镜改变放大倍率放大倍率 目镜改变目镜改变视场视场（环状光阑）（环状光阑） 视场直径也称视场范围，视场直径也称视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围，其纳被检物体的实际范围，其大小大小等于目镜的场值（视场数）除以物等于目镜的场值（视场数）除以物镜的放大倍数镜的放大倍数 目镜的场值目镜的场值(field number，FN)，是目镜的固定参数，标刻在目镜，是目镜的固定参数，标刻在目镜的外面，单位的外面，单位mm5.2 光学显微技术光学显微技术14目镜的眼点和视场：目镜的眼点和视场： 目镜目镜/物镜组合的选用：

12、物镜组合的选用： 为了达到同样的放大倍率，为了达到同样的放大倍率，可采用不同的目镜可采用不同的目镜/物镜组合物镜组合，但是，最佳的组合是应该，但是，最佳的组合是应该是既能保证对样品细节的分是既能保证对样品细节的分辨，又不至于做无用的放大辨，又不至于做无用的放大。有用的放大倍率应该介于有用的放大倍率应该介于(5001000)NA。(500-1000)NA=475-95060*15=90060*12.5=75060*10=60060* 25=150060*20=12005.2 光学显微技术光学显微技术15 集光器（聚光镜）集光器（聚光镜） 集光器的集光器的主要功能主要功能是照明样品，将视是照明样品

13、，将视场光阑成像在样品上，而将孔径光阑场光阑成像在样品上，而将孔径光阑成像在物镜的光瞳上。好的集光器有成像在物镜的光瞳上。好的集光器有利于显微镜达到其极限空间分辨率，利于显微镜达到其极限空间分辨率，改善样品照明的均匀性。改善样品照明的均匀性。 集光器有两种：集光器有两种：明视场集光器明视场集光器和和相差相差以及暗视场集光器以及暗视场集光器。 右图所示是集光器和物镜的组合。右图所示是集光器和物镜的组合。5.2 光学显微技术光学显微技术16 显微镜的照明方法临界照明：显微镜的照明方法临界照明： 直接照明物体，照明的光锥可以通过在集光器入瞳处的孔直接照明物体，照明的光锥可以通过在集光器入瞳处的孔径光

14、阑而控制，照明区域的大小是通过视场光阑来调节。径光阑而控制，照明区域的大小是通过视场光阑来调节。 缺点：缺点： 物场上光的强度不均匀物场上光的强度不均匀 当使用低放大倍数时像的亮度太强当使用低放大倍数时像的亮度太强5.2 光学显微技术光学显微技术17 显微镜的照明方法柯勒照显微镜的照明方法柯勒照明：明： 透射显微镜中最普遍的照明方透射显微镜中最普遍的照明方式为柯勒照明，可以提供均匀式为柯勒照明，可以提供均匀明亮的视场，无闪耀，对样品明亮的视场，无闪耀，对样品加热小。加热小。 视场光圈和聚焦光阑视场光圈和聚焦光阑分别放在分别放在成像光路和照明光路的共轭面成像光路和照明光路的共轭面上，这样就可以独

15、立控制对样上，这样就可以独立控制对样品的照明角度和强度。品的照明角度和强度。G G5.2 光学显微技术光学显微技术18 显微照相显微照相： 相机与显微镜的连接需要特殊设计的接口。相机与显微镜的连接需要特殊设计的接口。 接口的放大倍率接口的放大倍率取决于记录单元的面积以及中间像的大小。取决于记录单元的面积以及中间像的大小。5.2 光学显微技术光学显微技术19 由于相机的记录媒介（胶卷）和由于相机的记录媒介（胶卷）和CCD的面元尺寸的不同，因此其接的面元尺寸的不同，因此其接口光路是不同的，前者要对中间像做进一步的放大，而后者则往往口光路是不同的，前者要对中间像做进一步的放大，而后者则往往要缩小已经

16、放大的像。要缩小已经放大的像。 一般情况下，中间像的大小为一般情况下，中间像的大小为1520mm，而对于，而对于CCD相机，其有相机，其有效面元的尺寸要小于其标称值，比如，效面元的尺寸要小于其标称值，比如，1/2英寸英寸CCD的有效区域对角的有效区域对角线长度为线长度为8mm，1/3英寸英寸CCD相机有效区域对角线长度为相机有效区域对角线长度为5.3mm等等等。因此在上页图中，选择缩小一倍的接口可以基本上记录大部分等。因此在上页图中，选择缩小一倍的接口可以基本上记录大部分中间像。中间像。5.2 光学显微技术光学显微技术20 视频显微成像技术电子放大视频显微成像技术电子放大： 如果将如果将CCD

17、相机或摄像机的输出接到监视器上相机或摄像机的输出接到监视器上，那么总，那么总的放大倍率将是光学和电子放大倍率的乘积。的放大倍率将是光学和电子放大倍率的乘积。 光学放大倍率为：光学放大倍率为：Moptical=MobjectiveMadapter 电子放大倍率电子放大倍率为：为：Melectronic=diagonalmonitor/diagonalsensor 总的放大倍率为总的放大倍率为Moveral=MopticalMelectronic5.2 光学显微技术光学显微技术21 显微镜从光路上分有两种透射和反射显微镜从光路上分有两种透射和反射：5.2 光学显微技术光学显微技术22 正立和倒置显

18、微镜正立和倒置显微镜：5.2 光学显微技术光学显微技术23倒置显微镜：光路长，光损较大，光路设倒置显微镜：光路长，光损较大，光路设计较复杂，对样品高低无要求，检测方便计较复杂，对样品高低无要求，检测方便快速，不适合多视场分析，价格高。快速，不适合多视场分析，价格高。正立显微镜：光路设计简单，光损正立显微镜：光路设计简单，光损少，样品高度有要求，方便多视场少，样品高度有要求，方便多视场观察，镜头不易落灰易维护。观察，镜头不易落灰易维护。 1）暗场显微镜）暗场显微镜：暗场显微镜技术是利用暗场显微镜技术是利用斜射照明法斜射照明法阻阻挡透过标本细节的直射光，以反射光挡透过标本细节的直射光，以反射光和衍

19、射光来观察标本。和衍射光来观察标本。暗场显微镜的最关键部件是暗场显微镜的最关键部件是暗场聚光暗场聚光镜镜，能把投射到它表面的包含各个立，能把投射到它表面的包含各个立体角的光，转换成一个体角的光，转换成一个中空的光锥束中空的光锥束，并让这个光锥束的顶点中心在样品，并让这个光锥束的顶点中心在样品表面。表面。在普通显微镜下直射光透过标本，看在普通显微镜下直射光透过标本，看到的是物体形态和结构。而到的是物体形态和结构。而在暗场显在暗场显微镜下微镜下从侧面照射到物体的光束，绕从侧面照射到物体的光束，绕射或反射造成物体外形的侧影，射或反射造成物体外形的侧影，看到看到的是物体的轮廓或物体的运动。的是物体的轮

20、廓或物体的运动。5.2 光学显微技术光学显微技术24显微镜的几种观察方式显微镜的几种观察方式 暗场显微镜暗场显微镜： 效果对比效果对比5.2 光学显微技术光学显微技术25 2）相衬显微镜）相衬显微镜： 显微镜样品的像的形成取决于由样品所引起的光的变化，在光学显显微镜样品的像的形成取决于由样品所引起的光的变化，在光学显微镜中，最主要的变化是微镜中，最主要的变化是振幅变化和相位变化振幅变化和相位变化，在入射照明和透射，在入射照明和透射照明中这两个因素以不同的程度同时发生。照明中这两个因素以不同的程度同时发生。 常规显微镜中，像的反差主要是由光的吸收差异所引起的常规显微镜中，像的反差主要是由光的吸收

21、差异所引起的。当用单当用单色光照明时，改变了光的振幅，色光照明时，改变了光的振幅，于是各个结构部分显示出不同的亮于是各个结构部分显示出不同的亮度；度；当用白光照明时，由于吸收的不同改变了光谱的成分，当用白光照明时，由于吸收的不同改变了光谱的成分，不同的不同的结构部分便显示出不同的色彩。结构部分便显示出不同的色彩。 当光波通过一个当光波通过一个具有不同折射率的复杂透明物体具有不同折射率的复杂透明物体（如未染色的生物（如未染色的生物学切片），振幅保持不变，学切片），振幅保持不变，光的传播速度会发生变化光的传播速度会发生变化。 5.2 光学显微技术光学显微技术26 相衬显微镜相衬显微镜（1934,

22、Zernike） : 光入射到折射率较高的介质中，光入射到折射率较高的介质中，传播速度降低，离开介质后，振传播速度降低，离开介质后，振幅不变，但出现了幅不变，但出现了相位差相位差。 通过一定的光学装置可以通过一定的光学装置可以把相位把相位变化转变为振幅变化，把不可见变化转变为振幅变化，把不可见的相位像变为可见的振幅像，把的相位像变为可见的振幅像，把介质折射率或厚度的差异变为光介质折射率或厚度的差异变为光强度的差异，强度的差异，这就是相衬显微镜这就是相衬显微镜所依据的光学原理。所依据的光学原理。 相衬显微镜可以用来观察未染色相衬显微镜可以用来观察未染色的活体组织和细胞结构。的活体组织和细胞结构。

23、5.2 光学显微技术光学显微技术27 相衬显微镜：相衬显微镜：明场和相衬显微镜下的细胞图像明场和相衬显微镜下的细胞图像5.2 光学显微技术光学显微技术28 3）偏光显微镜）偏光显微镜： 偏光显微镜是一种具有偏光显微镜是一种具有起偏器、检偏器和补偿器起偏器、检偏器和补偿器等装置的特殊显微等装置的特殊显微镜，它可以用于对于镜，它可以用于对于具有各向异性的生物学材料具有各向异性的生物学材料如纤维蛋白、淀粉如纤维蛋白、淀粉粒、纺锤丝等的观察和定量研究。粒、纺锤丝等的观察和定量研究。 光的偏振光的偏振 自然光自然光 线偏振线偏振 圆偏振圆偏振 各向同性物质各向同性物质单折射性单折射性 各向异性物质各向异

24、性物质双折射性双折射性 o光：服从通常的折射定律光：服从通常的折射定律 e光：具有不同于正常光线的传播速度和折射率，异常光线的传播速度光：具有不同于正常光线的传播速度和折射率，异常光线的传播速度随着通过双折射材料光线的方向而变化。随着通过双折射材料光线的方向而变化。 在任何各向异性的材料中，至少可以找到一个方向，在这个方向上在任何各向异性的材料中，至少可以找到一个方向，在这个方向上o光光和和e光的传播速度相等，这个方向称为光轴。光的传播速度相等，这个方向称为光轴。5.2 光学显微技术光学显微技术29 偏光显微镜偏光显微镜： 右图：偏光显微镜的原理示意图右图：偏光显微镜的原理示意图 偏光显微镜的

25、特点偏光显微镜的特点，就是将普通光改，就是将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射性（各向同性）或某一物质是单折射性（各向同性）或双折射性（各向异性）。双折射性（各向异性）。 起偏器与检偏器起偏器与检偏器5.2 光学显微技术光学显微技术30 偏光显微镜偏光显微镜：下图：聚合体纤维（下图：聚合体纤维（Polymer fiber）的）的明场像、偏光像以及彩色偏光像明场像、偏光像以及彩色偏光像5.2 光学显微技术光学显微技术31 偏光显微镜偏光显微镜：5.2 光学显微技术光学显微技术32高密度柱状六角液晶小牛胸腺高密度柱状六角液晶小牛胸腺DNA的显微

26、照片（浓度大约的显微照片（浓度大约450毫克毫克/毫升，毫升，10X物镜的偏光显微镜测量）物镜的偏光显微镜测量） 4）微分干涉显微镜（）微分干涉显微镜（DIC）：）： 使照明光束通过起偏器并投射到石使照明光束通过起偏器并投射到石英棱镜上，在胶合面上光束分为寻英棱镜上，在胶合面上光束分为寻常光（常光（o光）和非寻常光（光）和非寻常光（e光）平光）平行地透过样品，经物镜后重新被两行地透过样品，经物镜后重新被两个石英棱镜会聚，可观察到样品面个石英棱镜会聚，可观察到样品面或内部的微小起伏图像的显微镜。或内部的微小起伏图像的显微镜。 沃拉斯顿棱镜沃拉斯顿棱镜5.2 光学显微技术光学显微技术33 微分干涉

27、显微镜：微分干涉显微镜： 在光路上与偏光显微镜类似，但在透射光路中在光路上与偏光显微镜类似，但在透射光路中多了一对双折射晶体（多了一对双折射晶体（2,6沃拉斯顿棱镜沃拉斯顿棱镜）；）； 第一个晶体用于将偏振光分解为两个振动方向第一个晶体用于将偏振光分解为两个振动方向垂直的偏振光，并发生横向的位移；垂直的偏振光，并发生横向的位移； 如果两个双折射光束通过完全相同的样品结构如果两个双折射光束通过完全相同的样品结构，那么经过样品后光程不会发生变化；但如果，那么经过样品后光程不会发生变化；但如果两束光经过的结构不同，那么到达像面时光程两束光经过的结构不同，那么到达像面时光程差会发生变化；差会发生变化；

28、 双折射晶体双折射晶体6消除两束偏振光的横向移动，而消除两束偏振光的横向移动，而检偏器检偏器7选择和其振动方向相同的移相波列；选择和其振动方向相同的移相波列； 这两列光波在像面发生干涉，将这两列光波在像面发生干涉，将光程差转换为光程差转换为强度差强度差并成像。并成像。5.2 光学显微技术光学显微技术34 微分干涉显微镜：微分干涉显微镜：5.2 光学显微技术光学显微技术35（a）绿头苍蝇嘴部的）绿头苍蝇嘴部的Nomarski透射光透射光DIC显微照片；显微照片；（b）硅铁合金表面瑕疵的反射光）硅铁合金表面瑕疵的反射光DIC显微照片。显微照片。Quiz 1常用的生物医学成像技术有哪些？这些成像技常

29、用的生物医学成像技术有哪些？这些成像技术相对于光学成像有哪些缺点？术相对于光学成像有哪些缺点？光学成像的优点是什么？光学成像的优点是什么？显微镜的主要部件有什么？显微镜的放大倍率显微镜的主要部件有什么？显微镜的放大倍率等于什么？等于什么？物镜镜体上的物镜镜体上的100 /1.4 Oil意思是什么？意思是什么？按照所成图像的对比度不同，显微镜有哪几种按照所成图像的对比度不同，显微镜有哪几种（说出三种的名字）？（说出三种的名字）？5.1 光学成像光学成像5.2 光学显微技术光学显微技术5.3 荧光显微技术荧光显微技术5.4 激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技

30、术多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术5.10 非线性光学成像技术非线性光学成像技术5.11 生物光子学成像技术的发展趋势生物光子学成像技术的发展趋势本本 章章 内内 容容3738 什么是荧光什么是荧光 荧光显微技术及其优点荧光显微技术及其优点 荧光探针（种类）荧光探针（种类） 常见的荧光显微技术：常见的荧光显微技术： 全场荧光显微技术：显微镜的结构全场荧光显微技术：显微镜的结构 图像获取（照相）和处理图像

31、获取（照相）和处理 荧光显微技术存在的问题荧光显微技术存在的问题 网上资源：网上资源： Introduction to Optical Microscopy,Digital Imaging, and Photomicrography /primer/index.html 5.3 荧光显微技术荧光显微技术3939主要内容：主要内容： 荧光原理：荧光原理： A-吸收光子吸收光子 F-荧光发射荧光发射 P-磷光磷光 S-单线态单线态 T-三线态三线态 IC-内转换内转换 ISC-系间交叉系间交叉n定义：

32、某些原子或分子吸收特定波长定义：某些原子或分子吸收特定波长 的光，并在短暂的光，并在短暂 (10-9-10-7s)停留后发停留后发射波长射波长 更长的光更长的光 (Stokes红移红移)，（光子的能量，（光子的能量E1/ )；n荧光现象与光学显微技术结合荧光现象与光学显微技术结合-荧光显微荧光显微 (荧光探针荧光探针)n研究细胞和亚细胞结构；细胞动力学研究细胞和亚细胞结构；细胞动力学 (比如扩散、酶动力反应速率、细比如扩散、酶动力反应速率、细胞功能胞功能 (比如比如 细胞的外吐细胞的外吐/内吞作用内吞作用)；免疫化学；监测；免疫化学；监测pH值、离子浓度、值、离子浓度、单个靶分子等。单个靶分子

33、等。5.3 荧光显微技术荧光显微技术401、什么是荧光、什么是荧光荧光的特征参量包括：荧光的特征参量包括：位置：位置：结构信息结构信息强度：强度：浓度信息浓度信息波长：波长：组分信息组分信息寿命：寿命：微环境信息微环境信息偏振：偏振：分子构象体积及微环境信息分子构象体积及微环境信息5.3 荧光显微技术荧光显微技术4141样品excfluo荧光强度激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱激光 excfluo光谱仪探测器波长、激发和发射谱波长、激发和发射谱5.3 荧光显微技术荧光显微技术4242Stokes红移：红移： 荧光分子在液体中可以观察到斯托克斯红移，原因：荧光分子在液体中可以观察到斯托克斯红移，

34、原因： 激发分子在发射荧光前快速的从较高的振动态退激发回到激发分子在发射荧光前快速的从较高的振动态退激发回到S1的最的最低振动能级。低振动能级。 荧光发射时，分子回到基态的较高振动能级。荧光发射时，分子回到基态的较高振动能级。 由于荧光团存在的溶剂效应、激发态反应、形成复杂的大分子以由于荧光团存在的溶剂效应、激发态反应、形成复杂的大分子以及能量转移等，也会产生斯托克斯红移。及能量转移等，也会产生斯托克斯红移。5.3 荧光显微技术荧光显微技术4343 荧光发射谱一般与激发光的波长无关：荧光发射谱一般与激发光的波长无关： 在荧光团分子被激发到高的电子态和振动能级后，过多的能量迅在荧光团分子被激发到

35、高的电子态和振动能级后，过多的能量迅速被损耗掉，使得荧光团分子停留在速被损耗掉，使得荧光团分子停留在S1的最低振动能级。这个退的最低振动能级。这个退激发过程一般在激发过程一般在1012 s内完成，是由于许多能量相等的不同振动内完成，是由于许多能量相等的不同振动能级重叠而引起的。正是由于这个快速的退激发过程，因此荧光能级重叠而引起的。正是由于这个快速的退激发过程，因此荧光的发射谱一般与激发波长无关。的发射谱一般与激发波长无关。 存在一些例外：存在一些例外： 对存在两种离子化状态的荧光团，每一个都有不同的吸收和发射对存在两种离子化状态的荧光团，每一个都有不同的吸收和发射谱。而且有些分子是从谱。而且

36、有些分子是从S2态发射荧光，不过，这些荧光发射一般态发射荧光，不过，这些荧光发射一般很少，在生物分子中很少见到。很少，在生物分子中很少见到。5.3 荧光显微技术荧光显微技术444430040050060070002040608010012014030000150002000025000fluorescencex 103molar extinction (1/cm M)wavelength (nm)wavenumber (cmwavenumber (cm-1-1) )S S2 2S S0 0S S1 1S S0 0S S1 1S S0 0vibronicvibronicvibronicvibro

37、nicNNNH2OSO3-O3SCy3Cy3的吸收和发射谱的吸收和发射谱5.3 荧光显微技术荧光显微技术4545Q 发射的光子数吸收的光子数荧光的量子产额：荧光的量子产额：发射光子数与吸收光子数之比，反映发射光子数与吸收光子数之比，反映了荧光团的发射效率。了荧光团的发射效率。荧光强度荧光强度正比于荧光团所吸收的光与它的量子产额的乘积。正比于荧光团所吸收的光与它的量子产额的乘积。xQIF0cI0: 入射到样品溶液的激发光的强度入射到样品溶液的激发光的强度: 发色团的摩尔消光系数发色团的摩尔消光系数c: 荧光团的浓度荧光团的浓度x: 光穿过溶液的路径长度光穿过溶液的路径长度0Q15.3 荧光显微技

38、术荧光显微技术4646荧光寿命：荧光寿命：是荧光分子的本征参量，定义为荧光分子被激发后，是荧光分子的本征参量，定义为荧光分子被激发后，回到基态并发射荧光分子之前在激发态平均停留的时间。回到基态并发射荧光分子之前在激发态平均停留的时间。)t(0e II(t)荧光寿命也定义为荧光强度衰减到初始强度荧光寿命也定义为荧光强度衰减到初始强度 I0 的的1/e （即（即37% ）所需的时间。）所需的时间。5.3 荧光显微技术荧光显微技术4747( )exp(/)iiI tat量子产额、本征寿命和测量寿命的关系量子产额、本征寿命和测量寿命的关系1rnrkk 1nrk rnrnrkQkk intrinsic

39、lifetimemeasured lifetimequantum yieldknrkrS0S15.3 荧光显微技术荧光显微技术4848kr ：辐射衰减常数：辐射衰减常数knr ：非辐射衰减常数：非辐射衰减常数 与其它光学显微（基于样品宏观结构不同，如相位梯度与其它光学显微（基于样品宏观结构不同，如相位梯度、光吸收、双折射等）不同，、光吸收、双折射等）不同，荧光显微基于荧光发射特荧光显微基于荧光发射特征，能够对单分子种类及其分布进行成像征，能够对单分子种类及其分布进行成像。 自体荧光：生物样品本身发射荧光自体荧光：生物样品本身发射荧光 外源荧光：需要用能够发射荧光的化学试剂标记样品。外源荧光：需

40、要用能够发射荧光的化学试剂标记样品。 荧光探针荧光探针=荧光染料（能够实现电子跃迁的分子）荧光染料（能够实现电子跃迁的分子） 当连接到大分子上时（核酸、蛋白质）当连接到大分子上时（核酸、蛋白质）= 荧光团（内源荧光团（内源荧光团，如荧光团，如GFP、芳香族化合物、卟啉、外部合成的染、芳香族化合物、卟啉、外部合成的染料、抗体等）料、抗体等）5.3 荧光显微技术荧光显微技术492、荧光显微技术、荧光显微技术反射光路荧光显微反射光路荧光显微 = 入射入射光荧光显微光荧光显微= episcopic fl =epi-fl ：是目前全场、共是目前全场、共焦和多光子荧光显微镜所焦和多光子荧光显微镜所采用的结

41、构。采用的结构。5.3 荧光显微技术荧光显微技术50落射荧光显微镜落射荧光显微镜荧光显微技术是生命科学研究的重要工具，其优点包括：荧光显微技术是生命科学研究的重要工具，其优点包括：p 利用滤光片消除激发光，具有高的成像对比度和信噪比；利用滤光片消除激发光，具有高的成像对比度和信噪比；p 可以在可以在2D或或3D空间测量样品的荧光参量（如强度、寿命、波长和空间测量样品的荧光参量（如强度、寿命、波长和偏振等），多维、信息量大；偏振等），多维、信息量大；p 无损或损伤小；无损或损伤小；p 适用于活体细胞和组织；适用于活体细胞和组织；p 可测量样品的自体荧光，或者用荧光探针（染料、荧光蛋白、量子可测量

42、样品的自体荧光，或者用荧光探针（染料、荧光蛋白、量子点等）标记活细胞内的特定蛋白，并进行定位。点等）标记活细胞内的特定蛋白，并进行定位。5.3 荧光显微技术荧光显微技术5151激发滤光片激发滤光片(EF)(EF)选择激发光波长，选择激发光波长，截止滤光片截止滤光片(BF)(BF)选择波长更长的弱荧光信号，选择波长更长的弱荧光信号， 从而从而使荧光图像具有暗背景，因此灵敏度高。使用使荧光图像具有暗背景，因此灵敏度高。使用双色分束镜（双色分束镜（DMDM）将激发光和荧光分离。将激发光和荧光分离。双色镜在反射式荧光显微照明中的作用双色镜在反射式荧光显微照明中的作用5.3 荧光显微技术荧光显微技术52

43、3 3、荧光探针、荧光探针5.3 荧光显微技术荧光显微技术53 用于生物成像的有内源性（用于生物成像的有内源性（endogenous）荧光团）荧光团和外源性（和外源性（exogenous）荧光团。）荧光团。理想的荧光团必须满足以下要求：理想的荧光团必须满足以下要求： 荧光团在生物媒质中具有很好的分散性，便于探测；荧光团在生物媒质中具有很好的分散性，便于探测； 具有和目标分子、细胞器或细胞特定结合的能力；具有和目标分子、细胞器或细胞特定结合的能力； 高量子辐射效率；高量子辐射效率； 环境稳定性；环境稳定性； 不会有光漂白现象。不会有光漂白现象。53生物学中所使用的荧光探针生物学中所使用的荧光探针

44、自体荧光自体荧光荧光染料荧光染料荧光蛋白荧光蛋白量子点量子点( (纳米晶体纳米晶体) )内源的亮度高，不同光谱范围，相对稳定，大的斯托克斯红移，小尺寸，可对环境敏感与目标蛋白融合，活细胞表达，用于标记破坏，对微环境参数敏感亮度非常高，光稳定性好，谱可调谐，激发谱宽，发射谱窄不可控制，一般为干扰噪声细胞内蛋白的特异标记困难，抗体标记，细胞一般要固定选择性有限，光稳定性低，亮度低，谱重叠大（5nm）细胞内的特异标记比染料更为困难，尺寸大（10-15nm）5.3 荧光显微技术荧光显微技术54荧光团种类荧光团种类 优点优点 缺点缺点541 1）内源性荧光团）内源性荧光团5.3 荧光显微技术荧光显微技术

45、55吸收光谱吸收光谱荧光光谱荧光光谱常见内源性荧光团：黄素常见内源性荧光团：黄素(flavin)、NAD(P)H、脂褐素、脂褐素(lipofuscin)、弹性蛋白、弹性蛋白(elastin)和胶原质和胶原质(collagen)等。等。55重要特性：重要特性：消光系数消光系数量子效率量子效率斯托克斯红移斯托克斯红移光谱宽度光谱宽度 观察时间观察时间光稳定性光稳定性寿命寿命5.3 荧光显微技术荧光显微技术562 2）荧光染料）荧光染料对细胞进行染色对细胞进行染色56亮度亮度谱分离谱分离Nobel Prize bovine vascular endothelial cellDIC: bovine v

46、ascular endothelial cellThree-color fluorescenceThree-color fluorescence荧光标记可以分辨生物样品的精细结构荧光标记可以分辨生物样品的精细结构5.3 荧光显微技术荧光显微技术5757负鼠肾脏上皮细胞（负鼠肾脏上皮细胞（OK线）线）人宫颈腺癌细胞人宫颈腺癌细胞 (HeLa Line) 采用基因转染技术，可以使细胞本身发出荧光，产生自己的探针。采用基因转染技术，可以使细胞本身发出荧光，产生自己的探针。如如GFP，YFP，DsRed，CFP等。等。研究生命的分子过程；研究生命的分子过程；实现分辨率达到实现分辨率达到10nm的单分子

47、成像；的单分子成像；在纳米尺度对细胞内分子的相互作用以及组织中细胞的相互作用进行成像。在纳米尺度对细胞内分子的相互作用以及组织中细胞的相互作用进行成像。3 3）荧光蛋白）荧光蛋白5.3 荧光显微技术荧光显微技术58584）量子点）量子点Quantum dots又称为半导体纳米微晶体（又称为半导体纳米微晶体（semiconductor nanocrystal），是一种由），是一种由-族或族或-族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是CdX（X=S, Se, Te）QD由于由于粒径很小（约粒径很小（约1100nm），），电子和空穴被量子限域，连续能电子和

48、空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光很相似，可以发射荧光 。与传统荧光团（有机染料）相比，量子点具有与传统荧光团（有机染料）相比，量子点具有窄的、可调的、对称窄的、可调的、对称的发射光谱的发射光谱、高的发光亮度和光化学稳定性高的发光亮度和光化学稳定性，可应用于生物单分子，可应用于生物单分子检测和生物纳米技术。检测和生物纳米技术。5.3 荧光显微技术荧光显微技术59595.3 荧光显微技术荧光显微技术60605.3 荧光显微技术荧光显微技术6161Quantum dots5.

49、3 荧光显微技术荧光显微技术62激发谱宽，发射谱窄且对称。激发谱宽，发射谱窄且对称。62Quantum dots5.3 荧光显微技术荧光显微技术63尺寸不同，发射谱不同；尺寸不同，发射谱不同；激发谱宽，发射谱窄且对称。激发谱宽，发射谱窄且对称。63生物纳米颗粒生物纳米颗粒NP 单量子点易受杂质和晶格缺陷的影响，量子效率低。但单量子点易受杂质和晶格缺陷的影响，量子效率低。但当以其为核心，用另一种半导体材料包覆，形成核壳结当以其为核心，用另一种半导体材料包覆，形成核壳结构后，就可将量子产率提高到约构后，就可将量子产率提高到约50%甚至更高，并在消甚至更高，并在消光系数上有数倍的增加，因而有很强的荧

50、光发射。光系数上有数倍的增加，因而有很强的荧光发射。 目前已合成了多种核壳结构的纳米颗粒，如目前已合成了多种核壳结构的纳米颗粒，如CdS/Ag2S, CdS/Cd(OH)2, CdS/ZnS, ZnS/CdSe, ZnSe/CdSe, CdS/HgS, CdS/PbS等以及多层结构的等以及多层结构的CdS/HgS/CdS。 5.3 荧光显微技术荧光显微技术6464生物纳米颗粒生物纳米颗粒NP 以以CdSe为核心为核心ZnS为外壳的纳米颗粒为外壳的纳米颗粒(CdSe)ZnS具有许多具有许多特别的光学特性：特别的光学特性： 激发波长范围很宽，激发波长范围很宽， 因此不同大小的因此不同大小的(CdS

51、e)ZnS量子点可以由同一量子点可以由同一波长的光激发，给生物学研究带来很大方便；而对于不同的有机波长的光激发，给生物学研究带来很大方便；而对于不同的有机荧光分子则很难做到，常常要用不同波长的光来激发。荧光分子则很难做到，常常要用不同波长的光来激发。 具有较大的斯托克红移和狭窄对称的荧光谱峰（半高峰宽具有较大的斯托克红移和狭窄对称的荧光谱峰（半高峰宽FWHM常常只有常常只有40nm或更小），这样就允许同时使用不同光谱特征的量或更小），这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，而发射光谱不出现交叠，或只有很少交叠，使标记生物分子点，而发射光谱不出现交叠，或只有很少交叠，使标记生物分子荧光谱的区分、

52、识别变得很容易。子荧光谱的区分、识别变得很容易。 5.3 荧光显微技术荧光显微技术65655.3 荧光显微技术荧光显微技术6666定位定位(蛋白质、蛋白质、DNA和脂类和脂类)：靶标定位：靶标定位相互作用、构象变化：成像、追踪相互作用、构象变化：成像、追踪细胞环境的测量细胞环境的测量 (pH, Ca2+, 酶活动酶活动)：探针测量：探针测量基因表达：成像基因表达：成像选择探针的依据选择探针的依据:光谱分离光谱分离毒性毒性光稳定性光稳定性亮度亮度5 5）荧光探针的在体应用）荧光探针的在体应用5.3 荧光显微技术荧光显微技术67674 4、常见的荧光显微技术、常见的荧光显微技术全场荧光显微全场荧光

53、显微 HBO/XBO弧光灯弧光灯 CCD相机相机 价格便宜，灵敏度高，光谱价格便宜，灵敏度高，光谱选择性好选择性好荧光显微技术荧光显微技术 照明方法照明方法 探测器探测器 优点优点 共聚焦共聚焦 LSCNipkow激光激光激光激光/弧光灯弧光灯对比度高，成像深度深对比度高，成像深度深(150um)，分辨率更高，漂白实验分辨率更高，漂白实验PMT/APDCCD相机相机双光子双光子脉冲激光脉冲激光对比度高，成像深度更深对比度高，成像深度更深(500um)，分辨率更高，分辨率更高，PMT/APD5.3 荧光显微技术荧光显微技术6868 正置显微镜正置显微镜 倒置显微镜倒置显微镜全场荧光显微全场荧光显

54、微: :荧光显微镜的结构荧光显微镜的结构5.3 荧光显微技术荧光显微技术6969/primer/index.html荧光滤块荧光滤块filter cubes5.3 荧光显微技术荧光显微技术7070荧光显微：探测器荧光显微：探测器 PMT （光电倍增管）（光电倍增管） APD（雪崩光电二极管）（雪崩光电二极管） CCD（电荷耦合器件）相机（电荷耦合器件）相机 制冷型、慢扫描制冷型、慢扫描 增强型增强型 EM增益增益没有空间分辨率没有空间分辨率高灵敏度高灵敏度低噪声低噪声5.3 荧光显微技术荧光显微技术7171宽场荧光显微图像的采集宽场荧光显微图

55、像的采集CCD相机的参数：相机的参数：量子效率像素数像素大小帧速满井电子数读出噪声暗电流A/D转换（12到16位）非均匀性图像采集参数：图像采集参数：时间增益ROIBinning/primer/index.html5.3 荧光显微技术荧光显微技术7272宽场荧光显微图像的采集宽场荧光显微图像的采集软件：软件：数据采集（数据采集（CCD相机本身提供）相机本身提供）=原始图像（原始图像（e.g.TIFF文件）文件）12位位TIFF-所有信息；所有信息；8位位TIFF-如屏幕所示如屏幕所示图像处理（图像处理（e.g.Photoshop; NIH Image J etc）数据采集数据采集/图像处理（图像处理（e.g.Metamorph）优化全场采集：优化全场采集：显微镜的校准（照明的均匀性；球差；光阑，偏振片）显微镜的校准（照明的均匀性；球差；光阑，偏振片）最佳滤片组最佳滤片组合适的合适的CCD相机（在所测光谱范围有高的相机（在所测光谱范围有高的QE；噪声；放大）；噪声；放大）5.3 荧光显微技术荧光显微技术7373宽场荧光显微图像的处理宽场荧光显微图像的处理简单的图像处理包括：简单的图像处理包括： 减背景（暗图像减背景（暗图像/空视场）