PCR引物设计原理资料

1、PCR引物设计原理资料PCR引物设计原理资料 PCRPCR反应一般由三个步骤组成：反应一般由三个步骤组成： 模板的热变性；模板的热变性； 引物复引物复性到单链模板上；性到单链模板上； 热稳定热稳定DNADNA聚合酶催化的延伸聚合酶催化的延伸变性变性在应用在应用 Taq DNA Taq DNA 聚合酶进行聚合酶进行 PCR PCR 时，变性温时，变性温度在度在94-9594-95下进行，这也是下进行，这也是Taq DNATaq DNA聚合酶进聚合酶进行行3030个或个或3030个以上个以上PCRPCR循环而活力不受到过多循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。损失时能耐受的最高温度。有时把变

2、性时间设计为有时把变性时间设计为 5min5min，以便大分子模，以便大分子模板板 DNA DNA 彻底变性的概率。彻底变性的概率。对于对于 GC GC 含量为含量为 55% 55% 或更低的线性或更低的线性 DNA DNA 模板，模板，推荐推荐 PCR PCR 的变性条件是的变性条件是 94-95 94-95 变性变性45s45s。 复性温度（复性温度（退火温度退火温度）至关重要）至关重要！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；扩增效率会非常低； 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导

3、致非特异性而导致非特异性DNADNA片段的扩增；片段的扩增； 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的退火温度，通常比理论设计的引物和模板的TmTm值低值低 3-5 3-5 下进行。下进行。 最好通过对复性温度比两条引物的最好通过对复性温度比两条引物的Tm Tm 值低值低 2- 2-10 10 内进行内进行PCRPCR预实验（梯度）来对复性条件预实验（梯度）来对复性条件的优化。的优化。引物和模板引物和模板DNA 的复性的复性 对对 Taq Taq DNA DNA 聚合酶来说，最适温度为聚合酶来说，最适温度为72-78 72-78 ，时间约为，时间约为1min1min。引物的延伸引物的延伸与循环数

4、目与循环数目 哺乳动物哺乳动物 DNA DNA 为模板时，至少进行为模板时，至少进行2525个循环才能得个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为到足够量的扩增产物。一般为30-3330-33个循环。个循环。引物设计要点引物设计要点（1 1）碱基组成：）碱基组成： GCGC含量应在含量应在40%-60%40%-60%（ 45%-55% 45%-55% ）之间，）之间，4 4中中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如聚嘧啶序列，如AAAAAAAAAA等，没有二核苷酸重复等，没有二核苷酸重复序列，如序列，如GCGCGCGCGCGC等；等；（2 2）引

5、物长度：）引物长度： 引物中与模板互补的区应为引物中与模板互补的区应为18-2518-25个核苷酸长个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于度，上下引物长度差别不能大于3bp3bp，如上游，如上游引物为引物为19bp19bp，下游引物为，下游引物为24bp24bp等。等。（3 3）重复或自身互补序列：）重复或自身互补序列： 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。性。（4 4）上下引物的互补性：）上下引物的互补性： 一个引物的一个引物的33末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为因为PCRPCR中引物浓度

6、较高，会形成引物二聚体。中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个当一个PCRPCR有多对引物时，注意检查任何一个有多对引物时，注意检查任何一个33末端都末端都不能和不能和 其他任何引物互补。其他任何引物互补。（5 5）解链温度（）解链温度（Tm Tm 值）：值）： 计算出来的两个引物的计算出来的两个引物的 Tm Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 5 ，扩增产物的，扩增产物的 Tm Tm 值与引物的值与引物的 Tm Tm 值相差不值相差不能大于能大于10 10 ；引物的；引物的 Tm Tm 值一般为值一般为50-7050-70。 这些特性保证了扩增产物在每一个这些特性保证了扩增产物在每一个

7、 PCR PCR 循环可循环可有效变性。有效变性。（6 6）33末端末端3 3末端的性质非常关键。末端的性质非常关键。 如果可能的话，每个引物的如果可能的话，每个引物的3 3末端碱基为末端碱基为G G或或C C；最好不要；最好不要A A，或或AAAA等多聚等多聚A A；但不推荐但不推荐3 3末端有末端有.NNNCG.NNNCG或或.NNNGC.NNNGC序列的引物，序列的引物，GCGC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。高自由能促进发夹及引物二聚体产生。 当末端碱基为当末端碱基为 A A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；时，错配时引发链合成的效率大大降低； 当末端碱基为当末端碱基为T T时，

8、错配情况下亦能引发链的合成，所以一时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般般 PCR PCR 反应中，引物反应中，引物3 3末端的碱基最好选末端的碱基最好选T T、C C、G G，而不，而不选选A A。 引物引物33端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为当末位的碱基为A A时，即使在错配的情况下，也能有引发链时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为的合成，而当末位链为T T时，错配的引发效率大大降低，时，错配的引发效率大大降低，G G、C C错配的引发效率介于错配的引发效率介于A A、T T之间，所以之间，所以33

9、端最好选择端最好选择T T。？（7 7）5 5端序列添加限制性酶切位点：端序列添加限制性酶切位点：一些概念一些概念 有意链（有意链（Sense strandSense strand），正义链（），正义链（positive positive strandstrand），编码链（），编码链（coding strandcoding strand）；无意链（）；无意链（anti-anti-sense strandsense strand），负义链（），负义链（negative strandnegative strand），模板），模板链（链（template strandtemplate strand

10、） 正向引物正向引物 （forward primerforward primer）：处于）：处于DNADNA双链上游的引物。如用于双链上游的引物。如用于测序，则从测序，则从5 533方向读出方向读出 DNADNA正链的序列。正链的序列。 反向引物反向引物 （Reverse primerReverse primer）：处于目的）：处于目的DNADNA双链下游的引物。如用双链下游的引物。如用于测序，则读出于测序，则读出 DNADNA负链从下游到上游的反向序列。负链从下游到上游的反向序列。 Primer Premier 5.0 软件设计引物软件设计引物 是由加拿大的是由加拿大的 Premier Pr

11、emier 公司开发的专业用于公司开发的专业用于PCRPCR或测序引物以及杂交探针或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软的设计、评估的软件件 主要界面分为序列编辑窗口（主要界面分为序列编辑窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析（、酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 Motif Motif 正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互补（）、互补（complementedcomplemented）及反向互）及反向互补（补（revers

12、e complemented reverse complemented ）。）。正向（正向（As isAs is）反向（反向（reversedreversed）互补（互补（complementedcomplemented）Enzyme软件默认以表格方式显示酶切结果。单击软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq Seq 或或 MapMap，分别以序列或图示，分别以序列或图示的方式显示结果。的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。Motif Primer点击点击 SearchSearch，进行引物搜索，进行引物搜索Search criteria Searc

13、h criteria 窗口：多种参数可以调整。窗口：多种参数可以调整。Primer LengthPrimer Length常设置在常设置在181830bp,30bp,短了特异短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的除外，如加个酶切位点什么的。PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之之间，小于间，小于100bp100bp的的PCRPCR产物琼脂糖凝胶产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。上限倒

14、也不必要求苛刻。ManualSearch parameters ManualSearch parameters 人工搜索参数设置窗口。人工搜索参数设置窗口。Search stringencySearch stringency应选应选HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它参数默认就可以其它参数默认就可以。Search progress Search progress 窗口中显示窗口中显示Search CompletedOKSearch CompletedOK键键结果窗口结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优有三种显示形式，上游引物、下游引物和

15、成对显示。引物按优劣次序排列，满分为劣次序排列，满分为100100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。对于对于上述上述引物，如果其它各项指标还可引物，如果其它各项指标还可以，以，可可在引物末端去掉一个不满意在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。估参数有没有变好点。搜索出来的引物，按搜索出来的引物，按RatingRating排序，排序，逐个送逐个送OligoOligo软件里评估。软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它短，你可以不选择它。引

16、物引物3 3端端22个个A A或或T,T,或引物内部连续或引物内部连续的的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端22个个G G或或C C，这样的引物应作为次选，没得选了就这样的引物应作为次选，没得选了就选它。选它。该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”S”和和“A”A”可查看有义链或反义链的引物。右边可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引

17、物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析引物长度：控制着引物的特异性和在引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。Tm 融链温度：根据相邻二碱融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链

18、温基对作用原理来计算融链温度。度。PCR 反应的合适反应的合适 Tm 范范围为围为56-63 （50-70）GC% 含量：对于含量：对于PCR 反应来说反应来说 GC含含量在量在50% 左右比较合左右比较合适。适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免性，尽量避免3末端的多义性，末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。配都能阻止引物延伸。 BLAST 验证引物验证引物 , 点击点击Basic BLAST中的中的 nucleot

19、ide blast 选项选项 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence栏中输入引物序列：栏中输入引物序列： 例例：引物为引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; 5-TGCCCATCACAACATCATCT-35-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 5 3 3。输。输入上游引物后，加上入上游引物后，加上2020个字母个字母n n，再输入下游引物。，再输入下游引物。 在在Choose Search

20、SetChoose Search Set栏中：栏中：DatabaseDatabase根据预操作基因根据预操作基因的种属定了，可选的种属定了，可选Human genomic + transcriptHuman genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：选择中：选择Somewhat similar sequences Somewhat similar sequences (blastn)(blastn)项，如下图：项，如下图： 在此界面最下面关键要点击在此界面最下面关键要点击Algorithm

21、parametersAlgorithm parameters参数参数设置，进入参数设置界面。设置，进入参数设置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望阈值须改为期望阈值须改为10001000，大，大于于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框将数字改为的下拉框将数字改为7 7。图中：序列与引物匹配的得分值小于图中：序列与引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分

22、分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/PlusStrand=Plus/Plus）、）、并与下游引物互补（并与下游引物互补（Strand=Plus/MinusStrand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转

23、到该基因的结果信息概要。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。Accession，数据库系列数据库系列的身份证：点击之后的身份证：点击之后可以获得该序列的信可以获得该序列的信息息Desscription序列序列的的简单描述简单描述高的就是有两线段间有连线高的就是有两线段间有连线的的代表随机匹配的可能性代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配也就是说序列完全匹配了。了。比对到的序列长度比对到的序列长度E值越小为好！值越小为好！匹配上的碱基数占总匹配上的碱基数占总序列长度的比例序列长度的比例缺失或插入，用缺失或插入，用“-”来表示来表示Query1、

24、2表示输入的表示输入的两对引物，两对引物，Sbjct表示在表示在库里比对的序列库里比对的序列Primer BLAST的详细结果的详细结果ncbi 在线在线 primer 设计设计默认的参数实际上是从默认的参数实际上是从100到到1000，这个，这个你得自己改，如果你希望产物的大小你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，符合你的预期，尽可能把范围改小，比如比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在物跨过内含子，这样避免潜在DNA对对RT-PCR的干扰。的干扰。 用用OligoOligo软件软件设计设计

25、/ /评估评估PCRPCR引物引物 启动启动OligoOligo，选择，选择FileFileopenopen，打开要进行引物分析的序列。，打开要进行引物分析的序列。 图中显示的三个指标：图中显示的三个指标：TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火温度窗口是设计引物的退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助主窗口，其他两个具有辅助作用。作用。 因为分析要涉及多个指标，启动窗口的因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade Cascade 排列方式排列方式不太方便，可从不太方便，可从windowswindows菜单改为菜单改为TileTile方式。

26、方式。用用TileTile方式显方式显示窗口示窗口TmTm，退火温度窗口，退火温度窗口TmTm值曲线以选取值曲线以选取7272附近为佳；附近为佳；5 5到到3 3端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。圈出来的序列部分及黄色的圈出来的序列部分及黄色的barbar即代即代表当前分析的表当前分析的2121个碱基的个碱基的TmTm值值 可点击窗口的左下角的可点击窗口的左下角的UpperUpper、LowerLower按钮按钮选择上游引物、下游引物。选择上游引物、下游引物。 TmTm值似乎太低了值似乎太低了TmTm值似乎太高了值似乎太高了显示了装载的整个序列的显示了

27、装载的整个序列的 6-7 mers6-7 mers寡核苷酸顺序的相对频寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的率。寡核苷酸的3 3端如果在一个特定的数据库端如果在一个特定的数据库（GenBankGenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。那么更容易导致错误引发。FrequenciesFrequencies，碱基频率窗口，碱基频率窗口如果选择出现频率较低的位点作为如果选择出现频率较低的位点作为3 3末端，那么就减少了在复杂的底物末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个（比如整个基因组基因组DNADNA）内的许多位点结合、引发的几

28、率，从而）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性减少了非特异性PCRPCR产物的形成。产物的形成。 平均频率为平均频率为10001000的话，的话，CTTGGCCTTGGC的频率的频率为为15001500以上，而以上，而TTGGCGTTGGCG德频率很低，德频率很低，约约300300。GG，序列内部碱基稳定性窗口，序列内部碱基稳定性窗口 显示了寡核苷酸的内部稳定性显示了寡核苷酸的内部稳定性( (五聚体的自有能五聚体的自有能) )。-1.9-1.9值值=-=-（3.1+3.1+3.1+1.63.1+3.1+3.1+1.6）GG值反应了序列与模板的结合强度；值反应了序列与模板的结合强度；

29、最好引物的最好引物的GG值在值在5 5端和中间值比较高，而在端和中间值比较高，而在3 3端相对低。端相对低。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能近碱基决定的，以自由能GG表示。表示。第二个核苷酸第二个核苷酸第一个（第一个（5 5）核苷酸）核苷酸例子：双链例子：双链d d（ACGG/CCGTACGG/CCGT）的）的GG是：是： G G（ACGGACGG）=G=G（ACAC）+ +GG（CGCG）+ +GG（GGGG） 显示了显示了3 3末端序列末端序列GG值较低，值较低，适合引发。适合引发。 3 3末端序末端序列列GG太

30、高。太高。你可以在三个窗口中你可以在三个窗口中自行设计引物。自行设计引物。选择了自己认为顺眼选择了自己认为顺眼的位置，此时，点的位置，此时，点击击UperUper，上游引物，上游引物即可显示。即可显示。同时在序列下游寻找下同时在序列下游寻找下游引物，点击游引物，点击LowerLower，即可显示下游引物。即可显示下游引物。对你设计的引物对你设计的引物质量进一步分析。质量进一步分析。同时在序列下游寻找下同时在序列下游寻找下游引物，点击游引物，点击LowerLower，即可显示下游引物。即可显示下游引物。 参数设置与搜索选择参数设置与搜索选择searchfor primers and probes

31、searchfor primers and probes，进行如右图设置。进行如右图设置。 点击点击search rangessearch ranges，设置引物范围和，设置引物范围和 PCR PCR产物的大小产物的大小 点击点击parametersparameters，进行参数设置。，进行参数设置。因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选要选上。同时选compatible pairscompatible pairs默认下，对引物的要求：无二聚默认下，对引物的要求：无二聚体、体、3 3高度特异、高度特异、GC%GC%含量含量有限定、去除错误

32、引发引物等。有限定、去除错误引发引物等。 引物的长度及产物的长度设置。引物的长度及产物的长度设置。 Primer LengthPrimer Length设置在设置在181830bp,30bp,短了特异短了特异性不好，长了没有必性不好，长了没有必要要; ; PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之间，小于之间，小于100bp100bp的的PCRPCR产物产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。上限没有太多的限定。 普通设置、参数及更多参数普通设置、参数及更多参数 从高到低六个等级的

33、设定，从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，当对软件功能不了解时，应应选选very high/very high/HighHigh。 选选automatically change string automatically change string 后，搜索引物时，如果在高等后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索到引物对时级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等级来搜索，直自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。到找到为止。反向引物时用反向引物时用让引物的长度可以改变，以让引物的长度可以改变，以适应设定的适应设定的TmTm值或值或PEP

34、E（prime Efficeinceprime Efficeince）值）值（引发效率）。（引发效率）。可以限定所选引物对的最可以限定所选引物对的最大数目。大数目。实际上需要我们改动的只有实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验引物的长度，根据实验需求做相应改动。需求做相应改动。其他的参数就使用其他的参数就使用OligoOligo默认默认值，一般无需改动。值，一般无需改动。直接使用直接使用OligoOligo默认值，一般默认值，一般也无需改变。也无需改变。 参数设置完毕后，点击确认参数设置完毕后，点击确认OKOK，程序即进行引物搜索。，程序即进行引物搜索。引物搜索结果如入：引物搜索结果如入

35、： OligoOligo提供了按引物位置、提供了按引物位置、产物大小、退火温度、产物大小、退火温度、GCGC含量等的排列方式。含量等的排列方式。OligoOligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCRPCR分析分析窗口。窗口。PCRPCRoptimal annealing temperatureoptimal annealing temperature （最佳退（最佳退火温度

36、）火温度）数值得参考。在数值得参考。在PCRPCR摸索条件的摸索条件的时候，退火温度为其数值加减时候，退火温度为其数值加减2 2的范围就可的范围就可以了。以了。产物产物TmTm值与引值与引物物TmTm值（低的那个）的值（低的那个）的差异，一般控制在差异，一般控制在2020度以内。度以内。引引物间物间TmTm值的差异，一般控制值的差异，一般控制在在5-65-6度以内。度以内。引发效率：上（下）引物对于正、引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。负链正确引发效率比。最佳引物浓度最佳引物浓度在在Analyze Analyze 菜单中，菜单中，Oligo Oligo 提供了众多分析提供了众多

37、分析功能。选择相应的功能，功能。选择相应的功能，分析结果。分析结果。点击点击Selected primersSelected primers，会给，会给出两条引物的概括性信息出两条引物的概括性信息; ;其中包括引物的其中包括引物的TmTm值，此值值，此值OligoOligo是采用是采用nearest neighbor nearest neighbor methodmethod计算，会比计算，会比Primer5Primer5中引中引物的物的TmTm值略高值略高; ;引物的引物的Delta GDelta G和和33端的端的Delta Delta G G: : 33端的端的Delta GDelta

38、G过高，会在过高，会在错配位点形成双链结构并引起错配位点形成双链结构并引起DNADNA聚合反应，因此此项绝对聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过值应该小一些，最好不要超过9 9。Key InfoKey InfoDuplex formation Duplex formation ，引物二聚体，引物二聚体引物引物二聚体是影响二聚体是影响PCRPCR反应异常的重要因素反应异常的重要因素应避免，至少也要使设计的引物应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其形成的二聚体是不稳定的，即其G G值应该偏低值应该偏低由由退火温度决定，退火温度决定，5050的退的退火温度和火温度和65

39、65对二聚体的影响对二聚体的影响肯定肯定不一样不一样。The most stable 3-DimerThe most stable 3-Dimer Delta GDelta G绝对绝对值一般不要超过值一般不要超过4.5kcal/mol4.5kcal/mol。G G绝对值越绝对值越大结构越稳定。大结构越稳定。结合碱基对不要超过结合碱基对不要超过3 3个。个。t the most stable Dimer overallhe most stable Dimer overall绝对绝对值一般应小于多少值一般应小于多少kcal/molkcal/mol跟跟PCRPCR退火温度有关退火温度有关。实验实验表

40、明。表明。Hairpin formation Hairpin formation ，引物发夹结构，引物发夹结构Delta GDelta G绝对值一般不要绝对值一般不要超过。超过。结合碱基对不要超过结合碱基对不要超过3 3个。个。特定的发夹如果没有显示特定的发夹如果没有显示TmTm值，那么值，那么发夹结构就不容易形成发夹结构就不容易形成 。结合碱基对已经超过结合碱基对已经超过3 3个。个。在在3 3形成发夹会引发引形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引物的数了参加正式反应引物的数量量。Composition and TmComposition and Tm上

41、下游引物的上下游引物的GCGC控制在控制在40406060。最后一种是最后一种是Primer5Primer5所采用的方所采用的方法。法。Td is a normalized Tm in Td is a normalized Tm in 1M salt conditions1M salt conditionsthe Tm is a variable value, that the Tm is a variable value, that depends on salt and DNA depends on salt and DNA concentration set in the Search

42、concentration set in the Search Parameters windowParameters windowTmTm值高时错配很少，特值高时错配很少，特异性强。异性强。False priming sitesFalse priming sites，错误引发位点错误引发位点oligooligo会给正确引发效率和错误引会给正确引发效率和错误引发效率。发效率。一般的原则一般的原则：使误引发效率使误引发效率控制控制在在100100以下。以下。有时候正确位点的引发效率很高的有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到话，比如达到400400500500，错误引，错误引发效率超过发效率

43、超过100100幅度若不大的话，也幅度若不大的话，也可以接受。可以接受。PrimerPrimer的的priming efficiencypriming efficiency应该应该是错配地方的是错配地方的4 4倍左右，更多当然倍左右，更多当然更好。更好。下游引物对于下游引物对于负链，没有发负链，没有发现错误引发。现错误引发。Selected OligoSelected OligoPrimer pairsPrimer pairs系统设计出的所有引物对。系统设计出的所有引物对。internal stabilityinternal stabilityInternal stabilityInterna

44、l stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证低的弧形，最起码保证3 3端不要过于稳定。端不要过于稳定。引物引物3 3端过于稳定，很端过于稳定，很容易导致不适当扩增。容易导致不适当扩增。上游引物的参数上游引物的参数注意：必需把方框拉到上游引物处。注意：必需把方框拉到上游引物处。对应的下游引物的参对应的下游引物的参数数注意：必需把方框拉到下游引物处。注意：必需把方框拉到下游引物处。Hybridization timeHybridization time，杂交时间，杂交时间该窗口显示了不同长度、不同浓度的寡该窗

45、口显示了不同长度、不同浓度的寡核苷酸的杂交时间核苷酸的杂交时间 ConcentrationConcentration您只需点一下鼠标，就轻松地您只需点一下鼠标，就轻松地实现对你地引物、实现对你地引物、PCRPCR产物、产物、DNADNA模版链即时的浓度、体积、模版链即时的浓度、体积、ODOD值、分子量的转换。值、分子量的转换。该浓度窗口是一个强大的时间该浓度窗口是一个强大的时间保存计算器。保存计算器。 OligoOligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式保存。的形式保存。 在软件所出现的任何一个窗口，选择在软件所出现的任何一个窗口，选择Filedata AsFiledata As，把数据存，把数据存为一个文本文件。为一个文本文件。文本保存的结果如下：文本保存的结果如下：最佳退火温度最佳引物浓度、盐浓度Primer premier 5Primer premier 5设计引物设计引物OligoOligo引物评估引物评估 举例说明：举例说明：ncbincbi里查找里查找基因基因 LIF LIF 的