叶绿素含量的测定

1、基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定基础生物学实验（三）基础生物学实验（三）基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程一、实验目的一、实验目的 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素绿素a和和b的方法及其计算。的方法及其计算。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程二、实验原理及要求二、实验原理及要求 1 1、 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提

2、取液中各色素的含量。根据朗伯取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的比尔定律，某有色溶液的吸光度吸光度A A与其中溶质浓度与其中溶质浓度C C和液层厚度和液层厚度L L成正比，即成正比，即A ACLCL式式中：中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为为1cm1cm时，时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合下的吸光度而求得。如

3、果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。的总和。这就是吸光度的加和性。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a a、b b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度特定波长下的吸光度A A，并根据叶绿素，并根据叶绿素a a、b b及类及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定

4、叶绿素在测定叶绿素a a、b b时为了排除类胡萝卜素的干扰，时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。收峰。2 2、了解叶绿素、了解叶绿素a a和和b b及总量的最大吸收峰，学会分及总量的最大吸收峰，学会分光光度计的使用方法及其原理。光光度计的使用方法及其原理。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程三、实验材料、试剂与仪器设备三、实验材料、试剂与仪器设备 （一）材料：（一）材料： 新鲜的绿色植物叶片。新鲜的绿色植物叶片。 （二）仪器设备：（二）仪器设备： 1. 1. 分光光度计；分光光度计；2. 2. 电子天平

5、（感量电子天平（感量0.01g0.01g）；）；3. 3. 研钵；研钵；4. 4. 棕色容量瓶；棕色容量瓶；5. 5. 小漏斗；小漏斗；6. 6. 定量滤纸；定量滤纸；7. 7. 吸水纸；吸水纸；8. 8. 擦擦境纸；境纸；9. 9. 滴管。滴管。 （三）试剂：（三）试剂： 8080丙酮；石英砂丙酮；石英砂. .基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程四、操作步骤四、操作步骤 1 1、取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组、取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎织表面污物，剪碎( (去掉中脉去掉中脉) )，混匀。，混匀。 2 2、称取剪碎的新鲜样品、称取

6、剪碎的新鲜样品0.2g0.2g，放入研钵中，加少量石英砂，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及和碳酸钙粉及5ml5ml80%80%丙酮，研成均浆，再加丙酮，研成均浆，再加80%80%丙酮丙酮10ml10ml，继续研磨至组织变白。静置，继续研磨至组织变白。静置3 35min5min。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程3 3、取滤纸、取滤纸1 1张，置漏斗中，用张，置漏斗中，用80%80%丙酮湿润，沿玻棒把提取丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到液倒入漏斗中，过滤到25ml25ml棕色容量瓶中，用少量棕色容量瓶中，用少量80%80%丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒

7、入丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。漏斗中。4 4、用滴管吸取、用滴管吸取80%80%丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80%80%丙丙酮定容至酮定容至25ml25ml，摇匀。，摇匀。5 5、把叶绿体色素提取液倒入光径、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm1cm的比色杯内。以的比色杯内。以80%80%丙酮为空白，在波长丙酮为空白，在波长663nm663nm、645nm645nm下测定吸光度。下测定吸光度。基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 6

8、6、结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：、结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=12.7A663Ca=12.7A6632.69A6452.69A645； Cb=22.9A645Cb=22.9A6454.69A6634.69A663； 据此即可得到叶绿素据此即可得到叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的浓度（的浓度（CaCa、CbCb：mg/Lmg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/gmg/g）= = 叶绿素的浓度叶绿

9、素的浓度提取液体提取液体积积稀释倍数稀释倍数/ /样品鲜重（或干重）。样品鲜重（或干重）。基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程五、注意事项五、注意事项 1 1、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行；研、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行；研磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。 2 2、过滤时必须将滤纸及叶片残渣洗至无绿色为止。比色、过滤时必须将滤纸及叶片残渣洗至无绿色为止。比色时提取液不能混浊。时提取液不能混浊。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程六、作业六、作业 1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素a与叶绿素与叶绿素b的比的比值有无不同。值有无不同。 2、分光光度法和比色法有何异同？、分光光度法和比色法有何