第11章、定量分析技术

1、生物活性分子的分离与表征第10章、电泳技术第第1111章、定量分析技术章、定量分析技术第12章、组分分析技术第13章、生物活性测定技术第第11章、定量分析技术章、定量分析技术一、紫外吸收法二、Bradford法三、BCA法四、如何选择合适的蛋白定量方法物理性质：紫外吸收法化学性质：Folin酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16）。蛋白质的定量分析方法 蛋白质在紫外光区（蛋白质在紫外光区（1

2、90nm-360nm）有两有两个强烈吸收峰：个强烈吸收峰：280nm和和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸色氨酸(Trp)、和酪氨酸和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收有芳香环，可吸收280nm波长的光波长的光子，子，苯丙氨酸（苯丙氨酸（Phe）也也有微弱吸收有微弱吸收。蛋白质的。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相相同浓度的不同种类蛋白质，其同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差的吸收值差别很大别很大(图图1)

3、。 一、紫外吸收法图图1.1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱蛋白质和核酸的紫外吸收光谱图图A A是是1515g /mlg /ml蛋白的吸收光谱。图蛋白的吸收光谱。图A A中插图是中插图是1 1mg/mlmg/ml的牛免疫球蛋白的牛免疫球蛋白IgG(I)IgG(I)、牛血清白蛋白牛血清白蛋白( (B)B)和白明胶和白明胶( (G)G)的的吸收光谱吸收光谱 图图B B是是1010g /ml RNAg /ml RNA和和DNADNA的吸收光谱。的吸收光谱。 280 nm280 nm光吸收法：光吸收法： 根据吸光值或蛋白质摩尔消光系数的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。 如果已知某一蛋白质在28

4、0 nm处的摩尔消光系数() ，测定蛋白质溶液280 nm吸光值后，根据公式：c =A/，可直接计算出蛋白质浓度。 280 nm280 nm和和260 nm260 nm吸收差法：吸收差法： 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的核酸类物质，用280nm来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在210 nm的光吸收比280 nm强，因此可利用280 nm及260nm的吸光值之差来计算蛋白质的浓度。常用下列经验式估算： 蛋白质浓度蛋白质浓度=1.45 =1.45 A A280nm 280nm - 0.74 - 0.74 A A260nm260nm (mg/(mg/mLmL) ) 假设1 mg/m

5、L蛋白质溶液的A280nm为1。 215 nm215 nm和和225 nm225 nm的吸收差法的吸收差法: : 蛋白质的肽键在200-250 nm有强的紫外线吸收。其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短，光吸收越强。若选取215 nm可减少干扰及光散射，用215 nm和225 nm吸光值之差与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。因此，对稀溶液中蛋白质浓度的测定可用215 nm和225 nm光吸收差法。常用下列经验式估算： 蛋白质浓度蛋白质浓度=0.144=0.144（A A215nm 215nm - 0.74 - 0.74 A A225nm225nm） (mg/(mg/

6、mLmL) )优点：优点：不需添加任何试剂，因而对样品没有任何不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；破坏；测量极其简单迅速；测量极其简单迅速；蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。质。 缺点：缺点：干扰测定的影响因素多，尤其是干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和和DNA在在此波长均此波长均有强吸收有强吸收, 所以一定要考虑样品中是所以一定要考虑样品中是否有否有核酸。要得核酸。要得到准确可靠的结果，必须严格到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的控制样品溶液的pH和化学组成，和

7、化学组成，使待测样品和使待测样品和标准样品的实验条件一致。标准样品的实验条件一致。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。质，误差较大。 蛋白质定量方法的改进原法 双缩脲法改进 Folin-酚试剂法（Lowry法）改进 BCA法蛋白质+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +蛋白质+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +CuCu+ + +TyrTyr等等+ +试剂乙试剂乙化

8、合物2蛋白质+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +CuCu+ + +BCA化合物2 Lowry 法的改进法。法的改进法。 碱性条件下，蛋白分子中的肽键与碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形形成络合物，并成络合物，并将将Cu2+还原成还原成Cu+；Cu+与与BCA结合成紫色复合物，在结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈处吸收值与浓度呈正比。正比。二、BCA法与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。可耐受高达5%的表面活性剂。原理：原理：该方法由该方法由Bradford于于1976年建立。年建立。在

9、在酸性条酸性条件件下，考马斯亮蓝与蛋白下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长质结合后最大光吸收波长由由465465nmnm（红色）红色）转移为转移为595595nmnm（蓝色），蓝色），起作用的起作用的主要氨基酸是主要氨基酸是ArgArg，另外，另外，His, Lys, Tyr, His, Lys, Tyr, TrpTrp和和PhePhe也有作用。也有作用。2 25 5minmin呈最大光吸收，至呈最大光吸收，至少可稳定少可稳定1 1小时小时三、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）简便简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂剂影响因素较少。去污剂和两

10、性物质对测定有影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰干扰小于小于3000Da 的多肽无法测定的多肽无法测定蛋白浓度高时非线性蛋白浓度高时非线性配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝蓝G250实验操作步骤实验操作步骤 室温室温放置放置5分钟后测分钟后测595nm的光吸。的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。注意混匀，但不要剧烈震荡。 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白 ul 0 10 20 40 6

11、0 80 100 0 蒸馏水 ul 100 90 80 60 40 20 0 0 待测蛋白 ul - - - - - - - 100 Bradford 试剂 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml A595 四、如何选择合适的蛋白定量方法？定性分析（如纯化过程中）：可以使用简单、快捷的紫外吸收法；定量分析（蛋白纯品、双向电泳、west-blot等）：使用精度高的Bradford法或BCA法。Bradford法法BCA法法检测限0.5g0.5g检测时间30 min去污剂耐受范围SDS0.01%Triton X-1000.05%Tween 20, 60, 800.015%5

12、% SDS5% Triton X-1005% Tween 20, 60, 80还原剂耐受范围1M -巯基乙醇5mM二硫苏糖醇-巯基乙醇0.01%二硫苏糖醇1 mM检测值稳定时长1 h颜色会随着时间的延长不断加深其他染色液易沾染比色皿，最好使用一次性比色皿。EDTA10mM不能含有EGTABradford法和BCA法的选择注意事项1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。异。 2、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品寻找化学构成类似的标准