发酵复习重点

1、筛选菌株时需考虑的一些指标A. 菌的营养特征，可利用廉价的原料；B. 菌的生长温度应选择温度高于40的菌种，这可大大降低大规模发酵的冷却成本；C. 菌对所采用的设备和生产过程的适应性；D. 菌的稳定性；E. 菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；F. 产物易于从培养液中分离。诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。完全培养基(CM, Complete Medium) ：含有满足所有营养缺

2、陷型和野生型菌株生长所需营养物质的培养基，其中的生长因子多是通过添加蛋白胨或酵母高等天然物质而提供。基本培养基(MM, Minimal Medium)：不含生长因子的培养基，在MM上营养缺陷型不能生长，但野生型菌株则能生长。补充培养基(SM, Supplemented Medium)：补充了一种或数种生长因子，以满足特定的营养缺陷型生长的培养基营养缺陷型突变株的育种过程 诱变处理； 后培养： 在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟） 淘汰野生型： 降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩。 检出缺陷型 鉴定缺陷型差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点

3、。抗生素法：青霉素能杀死生长态的细菌而对休止态的细菌无作用。菌丝过滤法：适用于丝状真菌饥饿法：某些缺陷型菌株在某些培养条件下会因代谢不平衡自行死亡，可是如果在细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会因代谢平衡的恢复而避免死亡，从而可被浓缩。代谢类似物：只有调节功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代谢类似物，将关闭相关代谢物的合成，从而影响微生物的生长。微生物发酵产酶的生产方式固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵诱导调节：某些酶在通常情况下不合成或合成甚少，但加入“诱导物(Inducer)”后，就能大量合成，这种现象称为诱导(Induction)。阻碍调节：阻碍有两种类型： 尾产物(反

4、馈)阻碍和分解代谢产物阻碍提高酶产量的方法：条件控制：如添加诱导物、降低阻碍物浓度遗传控制：如基因突变、基因重组发酵培养基的要求 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。一、按纯度合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定天然培养基: 采用天然原料原料来源丰富(大多为农二、按状态固体培养基 体培养基 液体培养基三、按用途培养基按其用途可分为孢子（斜面） 培养基、 种子培养基和发酵培养

5、基三种无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。1、 生长因子从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。2、 前体前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。3、 产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂

6、。三、培养基设计的步骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法消毒与灭菌的区别消毒：是指用物理或化学方法杀死物料，容器，器具内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。灭菌：是用物理或化学方法杀死或除去物料和设备（环境中）所有有生命的有机体的技术或工艺过程。包括营养细胞，细菌芽孢和孢子1. 干热灭菌法常用的干热灭菌条件为在160下保温1h。主要是使微生物由于氧化作用而死亡。其不

7、如湿热灭菌有效。一些要求保持干燥的实验器具和材料(如培养皿、接种针等)常用干热灭菌。2. 湿热灭菌法使用饱和蒸气压灭菌。由于蒸汽有很强的穿透力，且在冷凝时放出大量的冷凝热，使蛋白质凝固变性而杀灭各种微生物。是最常用的灭菌方法。致死温度：杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所用的时间称为致死时间，温度愈高，致死时间愈短。湿热灭菌的优点1.来源容易，操作费用低，本身无毒；2. 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；3. 蒸汽有很大的潜热；4. 操作方便，易管理。微生物的热死灭动力学方程-dN/dt=KNN：任一时刻的活细菌浓度(个/L)t：时间(min)K：比热死速率常数(mi

8、n-1)积分得：lnN/N= -Kt分批灭菌将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽，培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程（也称为实罐灭菌）。连续灭菌的设计将配置好的培养基在向发酵罐输送的同时，加热，保温和冷却，进行灭菌。优点：比分批灭菌的温度更高，保温时间则比较短，有利于减少营养物质的破坏；灭菌过程中蒸汽用量平稳。缺点：设备比较复杂，投资较大。连续灭菌与间歇灭菌的比较间歇灭菌的优缺点 优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。连续灭菌的优缺点 优点 保留较

9、多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。影响灭菌的因素实际灭菌中，除了杂菌的种类，数量，灭菌的温度和时间外，培养基的成分， pH值，培养基中颗粒与泡沫等对培养基灭菌也有影响。空气含菌量的测定培养法：微生物学中已介绍过光学法 ：用粒子计数器通过微粒对光线的散射作用来测量粒子的大小和含量。空气除菌的方法1. 辐射灭菌2. 加热灭菌3. 静电除菌4 介质过滤介质过滤除菌利用有孔介质从气体中除去微生物过 滤 机 理A. 惯性碰撞 在气流速度较大时，是介质过滤的主要

10、作用。惯性冲击取决于微粒的动能，纤维阻力，气流速度；与气流速度成正比。B. 拦截在气流速度较小时才起作用，在介质过滤中非主要功能，气流速度与截留效应成反比。C. 步朗运动气流速度小时，是主要的作用，气流速度 与截留效应成反比。D. 重力沉降 作用很小。E. 静电吸附作用 直接拦截 惯性撞击 扩散拦截穿透率 穿透率：P=N2/N1数与原有微粒数的比值。Eg: 如果要求每1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过，原有颗粒数为5000(个/m3 )，即经过滤后要求无菌度N=10-3，则：P=10-3/(5000*60*V1)其： 为分批发酵的时间或过滤器的无菌周期(h)V1为通风量 m3/min (

11、时间换算)种子扩大培养菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：1. 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；2. 所采用发酵罐的容积3. 对于生长快的细菌，种子用量用量比例小

12、，故种子罐相应也少。种龄： 是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量： 是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。为加大接种量，还采用双种法、 倒种法、分割法和添加法。分批发酵是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。第一类型 产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开。第二类型 产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。

13、第三种类型 产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的。生长关联型 (第一类型）生长无关联型（第二，三类型）1. 如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；2. 如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。补料分批培养谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batchfermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法。连续发酵培养基料液连续

14、输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。所加的培养基是一种限制性基质，并保持在较低的恒定值。其它的条件，如溶氧、无机盐等，都很充足。恒化培养使培养基中限制性基质的浓度保持恒定恒浊培养使培养基中菌体的浓度保持恒定供氧与产物的合成溶解氧浓度过低（代谢异常，产量降低）；溶解氧浓度过高（代谢异常，菌体提前自溶）。供氧方面：液膜阻力是主要限制因搅拌的作用：1成小气泡，增大比表面积2体涡流运动，增加气液接触时间3液湍流运动，促进传质4菌体分散，避免结团亚硫酸

15、盐氧化法在Cu2+存在下，2SO32- + O2 2SO42-剩余的SO32-与过量的碘作用：SO32- + I2 SO42- + 2I-再用Na2S2O3滴定剩余的碘 S2O32- + I2 S4O62- + 2I-CO2对发酵的影响CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的基质。它是细胞代谢的重要指标。在发酵过程中， CO2有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑制作用。温度对发酵的影响及控制Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射发酵热的测定 通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热。温度对发酵的影响1响各种酶的反应速率和蛋白质性质2响发酵液的物理性

16、质如溶解氧，粘度，基质的分解吸收速率等3响生物合成的方向。发酵温度的控制通过在发酵罐中安装换热装置来控制温度发酵罐：夹套(10 m3以下)盘管(蛇管) (10 m3以上)pH对发酵过程的影响1. 微生物生长和生物合成的最适pH各类微生物都有其最适的和能耐受的pH范围。微生物生长阶段的最适pH与产物合成阶段的最适pH往往是不一样的，与菌种和产物的化学性质有关。2. 对菌体生长和代谢的影响pH影响酶的活性pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变3. 对发酵液或代谢产物物理化学的影响，特别是对产物

17、稳定性的影响。2. pH的控制调节基础培养基的配方培养基的成分，初始pH，缓冲剂补料控制直接加酸加碱；补加碳源或氮源，如补加生理酸性物质（ NH4)2SO4或碱性物质（氨水）； 补糖等。发酵罐分类n 根据反应是否需要氧气为基准：Ø 嫌气(厌氧)发酵罐Ø 通气(好氧)发酵罐按照发酵罐设备特点分类：Ø 机械搅拌通风发酵罐：包括循环式，如伍式发酵罐，文氏管发酵罐， 以及非循环式的通风式发酵罐和自吸式发酵罐等。Ø 非机械搅拌通风发酵罐： 包括循环式的气提式、 液提式发酵罐，以及非循环式的排管式和喷射式发酵罐。带有锥形底、 盖的圆柱形发酵罐全容积为：V = p 4

18、 D 2 (H + h 1 + h 2 )发酵罐罐数的确定 N=nt/24+1N：发酵罐个数（个）n：每24小时内进行加料的发酵罐数t： 发酵周期（ 小时）冷却水耗量的计算Q=WCP(t2-t1) (W:Kg/h) 搅拌器的作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触， 使氧溶解于发酵液中。搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（涡轮式）两类挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。微生物反应通风搅拌罐放大的方法-比拟放大1. 以几何相似放大。2. 以体积溶氧系数为基准的放大。3. 以P0/V相等为准则的比拟放大。4. 以单位培养液体积搅拌功率相等为基准的放大。5. 以搅拌涡轮尖端线速率为基准的比拟放大。6. 以混合时间相等为基准的比拟放大。染菌的原因1、 设备渗漏2、空气带菌3、种子带菌4、灭菌不彻底5、技术管理不善1.无菌的检查尘埃粒子检测无菌平板检测2.及发酵液无菌状况检测酚红肉汤培养基检测 平板划线 显微镜观察1.单罐染菌不是系统问题， 而是该罐本身的问题。 如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效一、 多罐染菌系统问题， 如空气过滤系统有问题， 特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底三、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底四、中后期