防己黄芪汤加减对急性脊髓损伤大鼠的组织形态学影响

1、防己黄芪汤加减对急性脊髓损伤大鼠的组织形态学影响               作者：高益斌 杨米雄 叶红明【摘要】  目的研究活血利水中药对脊髓急性损伤的治疗效果及其对脊髓组织病理改变的影响，探讨其作用机制 方法随机将120只脊髓损伤造模后的大鼠随机分为复方组、方组、方组和激素组。前三者和激素组术后分别给予中药治疗和甲基强地松龙，于术后24h、7d、14d、21d、28d观察各组大鼠脊髓运动功能恢复、脊髓局部钙离子浓度变化及脊髓组织学改变。结果复方组脊髓运

2、动功能评分、及抑制钙离子浓度优于激素组；复方组的病变与方、方组相比，有缩小病灶的表现。结论中药与激素在抑制脊髓损伤的进程中，能保护神经组织免受损伤、抑制BNDF增生及钙离子浓度上发挥有益作用。从功能和形态上证实中药较激素在近期治疗的类似性及远期疗效的有效性。 【关键词】  脊髓损伤 中医药治疗 脑源性神经生长因子 大鼠Abstract: Objective To evaluate the efficacy of Chinese medicine of stimulating blood circulation and reducing edema on treating acute

3、spinal cord injury, and discuss its functions mechanism by observing the dynamic pathological changes of spinal cord. Methods120 SD rats were divided into four groups:fufang group, fanggroup, fanggroup and methylprednisolone treated group. The modified method was adopted to make the models of spinal

4、 cord injury. The functional recovery of spinal cord, Ca2+ density and the pathological changes were observed dynamically in each group.Result The functional recovery of spinal cord was promoted, the damage and Ca2+ density were reduced. The vacuole area was diminished in spinal cord in the fufang g

5、roup. It also inhabited the secondary inflammation.Conclusion The benefited effects, inhibiting the pathological process of the damage, were preserving the neuron and promoting the proliferation of mesenchymal cell, resisting BDNF proliferation and Ca2+ density were observed in the fufang group. The

6、 efficacy of TCM and MP was proved by the functional evaluation and the morphologic observation not only in actual period but in long term.Key words: spinal injury; traditional Chinese medicine therapy; BDNF; rat   急性脊髓损伤(ASCI)在临床上多见，致瘫率高，其有两种创伤机制作用于脊髓，既原发性损伤及在其基础上发展起来的继发性损伤，如何防止继发性损伤的发生、发

7、展是目前研究的热点。本实验通过相关指标来评定防己黄芪汤加减对急性脊髓损伤的治疗效果，为临床应用提供实验依据。1  材料与方法11  药物与试剂111  药物  防己黄芪汤加减(方)：(防己12g，黄芪15g，三七6g，白术9g，丹参15g，人参6g，甘草6g，生姜5g，大枣6g。八珍汤加减(方)：(当归9g，川芎9g，白芍9g，熟地9g，人参9g，茯苓9g，甘草9g，续断9g，丹参15g。药材购自浙江省中医院。将上药加水500ml用中火反复煎煮成浓缩溶液，使每1ml水溶液相当于10g生药。甲基强地松龙，注射剂量30mg/kg。112  试剂&#

8、160; A：第一抗体GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)Ab4，美国Neomarkers公司；B：即用型ENVISION试剂盒：DAKO（丹麦）；C：DAB显色剂：SIGMA（美国）；D：缓冲液：PBS PH74 0。1M；枸橼酸盐缓冲液（A液：枸橼酸2101G，DW1000ml；B液：枸橼酸钠2941G，DW1000ml，枸橼酸盐缓冲液由A液及B液和DW按要求配合成PH值为6.0）。         12  动物及造模  120只SD大鼠，雌雄不拘，体重

9、240300g, 由浙江中医药大学动物实验中心提供。采用胥少汀脊髓半横切模型法1制作脊髓损伤模型。室温控制于1925。大鼠用2%戊巴比妥钠按45mg/kg腹腔麻醉达成后，俯卧位固定，以T9为中心，显露T9T11椎板和棘突，切除椎板和棘突，保护硬脊膜。注意术中无菌及细致性操作。术中用改良针刀统一行T11左脊髓半横切，可见大鼠下肢强烈抽搐及尾巴甩动，强调以术后损伤侧下肢出现完全瘫痪作为造模成功的标志。术野切口常规用稀PVP碘水及庆大霉素冲洗三遍。彻底止血后依次缝合肌肉、皮肤，关闭切口，切口表面涂以青霉素液，用无菌创可贴保护。术后肌注青霉素8万U/只，共3d。每日挤压膀胱2次，直到710后膀胱功能恢

10、复为止。术后注意笼内及时更换干燥消毒木屑垫料以保持干燥清洁，观察切口有无血肿、有无尿潴留、血尿、腹腔内出血、感染等并发症。13  分组与处理  120只大鼠在脊髓损伤造模术后按随机数字表分为复方组、方组、方组、激素组，每组动物30只。每日用药量按成人剂量的1/50，由胃管灌入。麻醉苏醒后30min灌药1次，每次灌服15ml，每日用药3次，术后第8天开始改为每日2次，剂量不变。复方组大鼠于术后1h开始注射方，分别于术后24h、7d各随机处死6只。第8天开始改灌方，再分别于术后14d、21d、28d再各随机处死6只；方组同复方组，但于第8天开始改为灌服生理盐水；方组术后1h开始

11、灌生理盐水，第8天开始改为灌方；激素组于术后开始肌注甲强龙(30mg/kg)。2  结果21  光镜观察211  复方组  伤后24h见灰质中央管附近白质出血，组织水肿，损伤部分神经细胞固缩坏死（图1）；伤后7d间质出血灶周围纤维间可见中性粒细胞，近中央管灰质部分水肿、坏死，存留大部分灰质内可见正常神经细胞，HE染色呈均匀浅红色，可见广泛分布的缺血性改变的神经细胞，尼氏体减少，胞核固缩，核仁部分固缩，少数核溶解，BDNF数量增加（图2）；伤后14d病损处出现软化灶，水肿较前减轻明显，能见少量的神经纤维，间质中有少许淋巴与单核细胞，BDNF增生明显；伤后2

12、1d可见大部神经细胞存在，脊髓结构清晰可辩，白质区可见少许胶质瘢痕，BDNF增生减慢（图3、4）。图1、2  神经细胞固缩坏死(略)图3、4  白质区可见少许胶质瘢痕(略)212  方、方组与复方组相比，方、方组的改变不大。方组大鼠脊髓损伤术后24h组织出血明显，细胞空泡变性，部分细胞核固缩消失、纤维丝断裂；术后714d，水肿程度减轻不明显，出血灶及神经元数目减少，BDNF增生明显，与同时期复方组相比组织坏死及空泡样变程度较重(图5)；14d以后所示神经因子细胞分布均匀，排列较规则，组织空泡坏死变较轻(图6)。图5、6  组织坏死、空泡祥变 (略)图7、

13、8  仅见少许BDNF增生(略)213  激素组  与复方组比较，大鼠损伤24h后出血灶散在，组织水肿、细胞空泡变性同复方组相似，大部分神经细胞形态基本正常，呈多角形，脊髓后角损伤严重(图7 HE免疫组化×100)；术后714d组织轻度疏松水肿，细胞核无明显固缩，神经因子结构基本完整，神经纤维极性完整，可见节细胞与神经纤维连接，仅见少许BDNF增生 (图8 免疫组化×100)；2周以后，脊髓组织结构清晰，后角部分恢复，灰质中空腔面积较小，BDNF增生不明显(图9  免疫组化×100)22  电镜观察  正

14、常大鼠的脊髓神经元胞体的超微结构保存良好，胞内有清楚的线粒体、成团的粗面内质网、分散的滑面内质网及高尔基复合体等细胞器。复方组术后24h电镜可观察到脊髓白质脱髓鞘区神经轴突变性，不规则断裂，线粒体和内质网肿胀，BDNF细胞核内染色边聚，(图9、10)7d后可见损伤区及其邻近区的核周体呈暗、亮变性及坏死，多数神经细胞增生聚集，后纤维瘢痕化（图11、12）。图912  BDNF细胞核边聚、后纤维瘢痕化(略)3  讨论神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)家族成员是主要的靶源性神经营养因子，由靶组织产生，通过轴突末端受体介导，经神经细胞轴突逆行运输到胞体，对神

15、经细胞的存活、分化和功能表达起着重要的作用。近年来的研究发现作为神经营养因子效应细胞的神经细胞，其本身亦具有产生神经营养因子的能力，即神经营养因子的自分泌作用。BDNF是广谱的神经营养因子,对脊髓运动神经元具有神经营养作用，能促进其存活、分化及功能表达，也能挽救损伤的脊髓运动神经元和感觉神经元。   脊髓损伤后组织坏死与修复具有不一致性,既破坏与修复过程各有其独立系统。换句话说，尽管组织坏死对修复产生不利影响，但一旦组织坏死过程停止后，不意味着肯定能产生有效的组织修复。本实验研究发现，在术后2周观察过程中，除了单核细胞和中性粒细胞减少外，少见有益的神经元和神经纤维的生长。提示早期治疗的关键在于减轻神经元及其纤维的损伤程度、减少其损伤数量，尽量降低脑源性神经生长因子的增生。本实验显示，早期的抗炎治疗能减轻脊髓的进行性坏死，降低其继发性损伤程度。术后不久运动功能的提高可能只是反映了残存组织的功能代偿而不是有组织再生。因为研究显示，术后如残留515的脊髓组织即可促使运动功能恢复，况且大鼠的代偿能力很强，更能早期恢复运动功能。从本实验的病理学研究可知，相比于方、方组，复方组与激素组大鼠脊髓在损伤后炎性细胞浸润的范围较小、损伤程度较轻。提示防己黄芪汤与甲基强的松龙可明显抑制脊髓横断损伤后