细胞周期及其调控讲义

1、医学分子细胞生物学医学分子细胞生物学 细胞周期及其调控细胞周期及其调控 Cell Cycle & Cell Regulation一、细胞周期概念一、细胞周期概念 细胞周期细胞周期（cell cyclecell cycle）：）：是指细胞从上一次是指细胞从上一次分裂结束开始生长，到下一次细胞分裂结束所分裂结束开始生长，到下一次细胞分裂结束所经历的过程，又称细胞增殖周期。经历的过程，又称细胞增殖周期。细胞周期时间细胞周期时间（T TC C） 细胞周期经历的时间。细胞周期经历的时间。（M期）期）DNA合成前期（合成前期（G1 gap1）DNA合成期（合成期（Synthsis phase）DN

2、A合成后期（合成后期（G2 gap2）前期前期中期中期后期后期末期末期细胞周期细胞周期中的细胞中的细胞G1期期G G2 2期期S S期期M M期期细胞周期分为：细胞周期分为：四个时期。四个时期。( (Mitosis,division）终端分化细胞终端分化细胞 G G0 0周期性细胞周期性细胞细胞类型（增殖特性）细胞类型（增殖特性） 周期性细胞周期性细胞： 始终保持旺盛的增殖活性。始终保持旺盛的增殖活性。 G0期细胞期细胞： 一般不分裂，暂不增殖细胞。一般不分裂，暂不增殖细胞。 终端分化细胞终端分化细胞 （无增殖能力细胞）（无增殖能力细胞） 结构和功能高度特化。结构和功能高度特化。 周期性周期性

3、 细胞细胞终端分化细胞终端分化细胞研究方法研究方法 ：流式细胞术流式细胞术 细胞同步化细胞同步化 生化方法等等生化方法等等 G1G1早期早期： 细胞体积增大、生物合成、细胞体积增大、生物合成、形成细胞器形成细胞器触发蛋白、钙调蛋白增加。触发蛋白、钙调蛋白增加。体积、表面积、核体积、表面积、核 质比质比 G1晚期晚期：H1及多种蛋白的磷酸化，为及多种蛋白的磷酸化，为DNADNA合成准备。合成准备。 信号分子调控信号分子调控 G0 G1晚晚S期期 start point （DNADNA合成相关酶，细胞周期运行的蛋白）合成相关酶，细胞周期运行的蛋白）1.1.DNADNA复制复制 多种酶的参与。多种酶

4、的参与。 2.2.蛋白质合成：（组蛋白、非组蛋白）组装核小体。蛋白质合成：（组蛋白、非组蛋白）组装核小体。3 3. 中心粒的复制，并发生分离，发挥微管的组织作用。中心粒的复制，并发生分离，发挥微管的组织作用。（三）（三）G G2 2期期（有丝分裂准备期）（有丝分裂准备期）1. 促有丝分裂因子促有丝分裂因子(MPF)合成合成2. 微管蛋白（微管蛋白（tubulin)合成合成3. 0.3%DNA复制复制 4 . 结结构功能蛋白的合成构功能蛋白的合成 G2期期 check point： （1） 是否完成是否完成DNA复制复制 ？ （2）是否有）是否有DNA错误复制？错误复制？有丝分裂的主要特征是：有

5、丝分裂的主要特征是： 姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。人为的划分为四个时期人为的划分为四个时期前期前期、中期中期、后期后期、末期末期。 （四）（四）M M期期 （有丝分裂期）（有丝分裂期）细胞有丝分裂过程细胞有丝分裂过程1.有丝分裂有丝分裂间期间期核核 膜膜核核 仁仁染色质染色质中心粒中心粒染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，核仁解体，核膜消失。核仁解体，核膜消失。前前 期期星体微管：星体微管：由中心体由中心体向外放射，末端结合向外放射，末端结合有分子马达，负责两有分子马达，负责两极的分离极的分离 极体微管

6、：极体微管：由中心体发出，在纺锤体中由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子部重叠，重叠部位结合有分子马达，负责将两极推开。马达，负责将两极推开。-+纺锤体有三种微管结构：纺锤体有三种微管结构：染色体的运动染色体的运动Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus. 染色体排列到在细胞的赤道面上。染色体排列到在细胞的赤道面上。赤道板赤道板中中 期期后后

7、 期期后期后期阶段染色体的分离由微管阶段染色体的分离由微管去聚合假说解释：去聚合假说解释：动粒微管不断解聚缩短动粒微管不断解聚缩短, ,造成造成的拉力将染色体拉向两极。的拉力将染色体拉向两极。机理机理：微管正端插入微管正端插入的外的外层层, ,微管在此端去组装。微管在此端去组装。动粒中动粒中的的ATPATP水解水解, ,提供能量提供能量, ,驱动微管上的马达分子向极驱动微管上的马达分子向极部移动部移动, ,拉动染色体向极移动。拉动染色体向极移动。l两个出现：核膜出现核膜出现、核仁出现核仁出现l两个消失：染色体消失染色体消失、纺锤丝消失纺锤丝消失中间小体中间小体。中间小体中间小体动物细胞的胞质分

8、裂通过胞质收缩环的收缩实现，收缩环由大动物细胞的胞质分裂通过胞质收缩环的收缩实现，收缩环由大量平行排列的肌动蛋白组成。量平行排列的肌动蛋白组成。用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？Dividing Muscle Myoblast (primative muscle cell)(SEM x8,000) 一、细胞周期调控蛋白一、细胞周期调控蛋白(cell cycle-regulating protein)(cell cycle-regulating protein) CDK类蛋白激酶类蛋白激酶 催化亚单位催化亚单位 细胞周期素（细胞周期素

9、（Cyclin) 调节调节亚单位亚单位 CDK抑制因子（抑制因子（CKI） 抑制抑制CDK激酶活性激酶活性 M M期促发期促发因子因子(MPF)(MPF)MPF的发现：一种在的发现：一种在（一）细胞周期调控研究过程的重要事件：（一）细胞周期调控研究过程的重要事件：CDK： (cyclin-dependent protein kinases）1.1. CDK类蛋白激酶类蛋白激酶（cyclin-dependent kinase）： CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故称细胞与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故称细胞周期素依赖性蛋白激酶周期素依赖性蛋白激酶( (cyclin-dependent

10、 kinase,CDK) )作用：作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。l在动物中已知在动物中已知7 7种种CDK，CDK1-7CDK1-7。l分为四类：分为四类：G1、G1/S、S期期CDK和和M期期CDK。2.2.细胞周期素细胞周期素（cyclins)是一类随细胞周期的变化呈现周期性出现和消失是一类随细胞周期的变化呈现周期性出现和消失的蛋白质。（的蛋白质。（A、B、C、D、E 等几类，亚型，等几类，亚型，20多种）多种）表达时间不同，执行功能多种多样。表达时间不同，执行功能多种多样。 特点：在细胞周期中呈周期性变化。特点：在细胞周期中呈周期

11、性变化。作用：能与作用：能与CDK结合，激活结合，激活CDK，间接调节细间接调节细胞周期运行。胞周期运行。D E A B 已知已知30余种，在脊椎动物中为余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。等。分为分为4类：类：G1型、型、G1/S型、型、S型、型、M型。型。 G1 、 G1 /S 、G2期期( Cyclin D、E 、A)M 期期 (Cyclin B)不同类型CDK-Cyclin复合物 *包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。3.3.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子

12、 （CDK inhibitor, CKI）CDKICDKI是对是对CDKCDK激酶起负性调控作用的蛋白质。激酶起负性调控作用的蛋白质。已发现多种已发现多种CDKICDKI INK4INK4家族家族: : p16p16、p15p15、p18p18、p19p19CIP/KIPCIP/KIP家族家族: : P21P21、2727、5757 在在G G1 1期抑制多种期抑制多种CDKCDK。 CKI对细胞周期起负调控作用，分为：对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特异性抑制特异性抑制cdk4-cyclin D1, cd

13、k6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数抑制大多数CDKCDK的激的激酶活性。酶活性。P21cip1还能与还能与DNADNA聚合酶聚合酶的辅助因子的辅助因子PCNA结合，直接抑制结合，直接抑制DNADNA的合成。的合成。M期期CDK的激活起始于分裂期的激活起始于分裂期cyclin的积累。的积累。结合结合M -cyclin的的CDK1被被Wee1（抑制因子）将抑制因子）将Thr14和和Tyr15磷酸化而不具有活性，使磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。不断积累。在在M期，期，Wee1的活性下降，的活性下降，CDC25磷酸酶使磷酸

14、酶使CDK去磷去磷酸化，去除了酸化，去除了CDK活化的障碍。活化的障碍。CDK的激活需要的激活需要Thr161的磷酸化，它是在的磷酸化，它是在CDK激酶激酶(CAK)的作用下完成的。的作用下完成的。 （三）（三）M期期CDK的的激活激活M期调控：期调控： 1. M-CDK活化活化 （ 涉及涉及CyclinB、CAK、cdc25、Well1） 2. CDK1 激发激发M期所有事件期所有事件 CDK1CDK1 APCAPCAPCAPC泛素蛋白连接酶复合体泛素蛋白连接酶复合体 M-CylinM-Cylin降解降解泛素蛋白泛素蛋白多聚化多聚化蛋白酶体蛋白酶体4.4.3.3.促后期蛋白复合体促后期蛋白复

15、合体（Anaphase Promoting Anaphase Promoting Complex)Complex) APCAPC M中中M后后 泛素蛋白泛素蛋白（Ubiquitin)Ubiquitin)cyclincyclin降解盒降解盒4. 4. CDK1CDK1活性下降活性下降 出出M M期期细胞核重建、染色体解螺旋、启动收缩机制。细胞核重建、染色体解螺旋、启动收缩机制。进出进出S S期调控：期调控： M期末期末 G1 CDKs 活性活性0 G1 ( G1 ( 晚期晚期) ) 增殖信号（激素、生长因子）增殖信号（激素、生长因子） G1 cyclin转录转录 cyclinD+cdk4/cdk

16、6 G1/S 转换转换 “Start” S 期期 DNA合成启动，合成启动， cyclin + CDK2 （SCDK） 保证精确复制（保证精确复制（pre RC）复制前复合体(prereplicationcomplex，Pre-RC)CDK activating。二、细胞周期限制点（二、细胞周期限制点（check point）Four Checkpoints（1）限制点在细胞周期调控中的作用）限制点在细胞周期调控中的作用细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检测，修复。测，修复。 Checkpoint： 1. DNA损伤检查点损伤检查点 2.

17、 DNA复制检查点复制检查点 3. 纺锤体组装检查点纺锤体组装检查点 G1-S G1-S DNA损伤、复制错误损伤、复制错误, 不能进入不能进入S期。期。 G2MG2M DNA复制错误，完整精确修复后可通过。复制错误，完整精确修复后可通过。 MM中期中期- -MM后期后期 纺缍丝组装纺缍丝组装/动粒连接错误时，细胞不能进入动粒连接错误时，细胞不能进入 后期后期 控制失调时即可引起各种染色体畸变，基因扩增、突变等控制失调时即可引起各种染色体畸变，基因扩增、突变等 癌发生癌发生 PDGFPDGF、EGFEGF、ILIL、TGFTGF、FGF NGF FGF NGF 等，等， 细胞外信号细胞外信号E

18、GF、PDGF等等具具TPK活性的受体活性的受体GRB2 PSOS PRas-GTP PRaf调节其他蛋白活性调节其他蛋白活性MAPKKMAPK P P P细细胞胞核核反式作用因子反式作用因子调控基因表达调控基因表达细细胞胞膜膜二聚化二聚化跨膜受体型TPK信号通路：信号通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。、磷脂酰肌醇途径。如通过如通过ras途径，激活途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核进入细胞核内，激活内，激活c-myc，myc作为转录因子促进作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等等G1-S有关的基因表达，细胞进入有关的基因表达，细胞进入G1期。期。Ras蛋白：蛋白：介导的M

19、APK信号转导途径是具有酪氨酸激酶活性的大多数生长因子及其受体传递信息的主要通路，是细胞周期正常运行的信号指令系统之一、主要由Ras蛋白 Ras转换因子(如Raf1) 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等部分组成。与丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化有关。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。 是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。作用于作用于G1期

20、的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入S期，称期，称S因子因子作用于作用于G2期的抑素可阻止细胞进入期的抑素可阻止细胞进入M期，称期，称M因子因子p53p53、P21P21及及Gadd45Gadd45在在G1G1阻滞中的作用阻滞中的作用P53P53有多种下有多种下游效应分子：如游效应分子：如MDM2MDM2，P21WAFlP21WAFl，Gadd45Gadd45，Bax,IGFBP3Bax,IGFBP3，FasFas等。等。MDM2MDM2通过与通过与P53P53蛋白氨基末端结合来阻止蛋白氨基末端结合来阻止P53P53蛋白转录蛋白转录激活，形成一个激活，形成一个“负反馈环负反馈环”。MDM

21、2MDM2的正常功能是限制的正常功能是限制GIGI期阻滞的时间，使期阻滞的时间，使DNADNA损伤修损伤修复后的细胞重新进入细胞周期。复后的细胞重新进入细胞周期。 Gadd45Gadd45和和P21WAFlP21WAFl是参与辐射所致细胞是参与辐射所致细胞G1G1期阻滞的重要期阻滞的重要分子。分子。P53P53P P21wAF121wAF1通路是通过通路是通过CDKCDK周期蛋白活性抑制，周期蛋白活性抑制，RbRb脱脱磷酸化而发挥作用的。磷酸化而发挥作用的。GaddGadd（growth arrest and DNA damagegrowth arrest and DNA damage）是一些

22、生长）是一些生长抑抑制和制和DNADNA损伤诱导的基因，损伤诱导的基因，Gadd45Gadd45是其中一员，也是野是其中一员，也是野生型生型P53P53诱导诱导G1G1期阻滞的一条通路。期阻滞的一条通路。参与的相关蛋白及其作用：参与的相关蛋白及其作用：(1) p21WAF1/CIP1p21基因定位于第六号染色体短臂上基因定位于第六号染色体短臂上(6p21.2），），P21蛋白定位于蛋白定位于细胞核中，属细胞核中，属CKI分子（分子（CDK抑制分子），能广泛抑制各种周抑制分子），能广泛抑制各种周期蛋白期蛋白CDK复合物。复合物。 野生型野生型P53蛋白作为转录因子可诱导蛋白作为转录因子可诱导p2

23、1WAF1/CIP1基因的表达，基因的表达，抑制抑制CDK2和和CDK4对对pRB蛋白的磷酸化失活，进而导致蛋白的磷酸化失活，进而导致G1、G1/S和和S期延迟，使期延迟，使DNA损伤有时间得以修复。损伤有时间得以修复。（2）ATM基因基因 AT：毛细血管扩张性共济失调症：毛细血管扩张性共济失调症;ATM基因是基因是AT唯一致病基因；唯一致病基因；对对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、蛋白增加、p21wAFl和和Gadd4

24、5转录和翻译水平增强的动态变化，表明转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是很可能是DNA损伤反应途径中损伤反应途径中p53的上游分子。的上游分子。ATMATM（ataxia telangiectasia-mutated geneataxia telangiectasia-mutated gene） 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%1%的人是的人是ATMATM缺失的缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。ATMATM编码蛋白激酶，与损伤编码蛋白激酶，与损伤DNADN

25、A结合，信号通路有两条结合，信号通路有两条: : 激活激活Chk1Chk1（checkpoint kinasecheckpoint kinase）, , 使使cdc25cdc25的的Ser216Ser216磷酸化失去活性，抑制磷酸化失去活性，抑制M-CDKM-CDK的活性，中断细胞周期。的活性，中断细胞周期。 激活激活Chk2Chk2，使，使P53P53被磷酸化而激活，然后被磷酸化而激活，然后P53P53作为转录因子，导致作为转录因子，导致P21P21的表达，的表达，P21P21抑制抑制G1-SG1-S期期CDKCDK的活性，中断细胞周期。的活性，中断细胞周期。(3) P16INK4aP16P

26、16INK4aINK4a基因位于人类染色体基因位于人类染色体9p21区，编码由区，编码由148个氨基个氨基酸组成的分子量为酸组成的分子量为16kD蛋白质。蛋白质。 P16P16INK4aINK4a与周期蛋白与周期蛋白D1竞争性结合竞争性结合G1期激酶期激酶CDK4CDK6，抑制其对，抑制其对pRB的磷酸化作用，使游离的的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的与未磷酸化的PRB结结合，依赖于合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，转录的基因不能转录，P16P16INK4aINK4a间接抑间接抑制包括制包括DNA合成在内的多种生化反应，使细胞周期正合成在内的多种生化反应，使细胞周期正常运行。常

27、运行。（4 4）pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化；磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢叶酸还原酶、TK及E2F-1基因等),促进这

28、些基因的表达；这些基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.G1/S调控点以调控点以pRb为中心构成一个复杂网络的为中心构成一个复杂网络的共同模式共同模式 细胞周期长短测定细胞周期长短测定脉冲标记脉冲标记DNADNA复制和细胞分裂指数观察测定法复制和细胞分裂指数观察测定法流式细胞仪测定法流式细胞仪测定法(Flow Cytometry)(Flow Cytometry)缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和

29、分裂期的准确时间。裂间期和分裂期的准确时间。细胞周期同步化细胞周期同步化1 1人工选择同步化（人工选择同步化（ 药物诱导法）药物诱导法） 条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用： 将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。中某一特定时期。人工选择同步化人工选择同步化2 2有丝分裂选择法：有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。用于单层贴壁生长细胞。优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。优点：细胞未

30、经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点：是缺点：是 分离的细胞数量少。分离的细胞数量少。密度梯度离心法：密度梯度离心法： 根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法优点：方法 简单省时，效率高，成本低。简单省时，效率高，成本低。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。药物诱导法（药物诱导法（DNA合成阻断法）合成阻断法） G1/S-TdR双阻断法：将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。分裂中期阻断法分裂中期阻断法 通过抑制微管聚

31、合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点：是操作简便，效率高。缺点：是这些药物的毒性相对 较大。一、一、DNADNA损伤的后果损伤的后果: :信号传导异常信号传导异常老化老化肿瘤肿瘤疾病疾病异常增生和代谢异常增生和代谢生理功能紊乱生理功能紊乱细胞死亡细胞死亡细胞增殖减少细胞增殖减少基因表达异常基因表达异常基因组不稳定基因组不稳定DNA 损伤损伤P21Gadd 45BaxP53CDK/cyclinGadd45 Gadd45-PCNABlocking cell cycleExcision repairingCell apoptosis二二 、细胞衰老的理论、细胞衰老的理论（一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累；（一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累； （二）（二） ROS引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤；引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤；（三）端（三）端 粒粒 钟钟 学学 说（说（telomere clock theory) （四）衰老基因与抗衰老基因（四）衰老基因与抗衰老基因 1.衰老基因衰老基因人类：