神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究

1、神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究                   作者：张立峰，茅祖斌，蒋赞利     【摘要】  目的：探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。方法：66只SD大鼠随机分为假损伤组（A组）、SCI对照组（B组）和细胞移植治疗组（C组）3组，应用已包被多聚左旋赖氨酸(P

2、LL)的SPIO标记NSCs,对标记细胞进行普鲁士蓝染色，分别在细胞移植后第1、2、3、4、5周对各组动物进行BBB评分，细胞移植后1、3、5周行MRI检查。结果：(1)普鲁士蓝染色证实该方法标记NSCs的有效率为100%。（2）细胞移植后15周,B、C组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P0.05)。（3）1.5 T MRI 检查 见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变。结论：MR技术可以活体追踪干细胞，NSCs移植治疗SCI有利于大鼠后肢功能的恢复。 【关键词】  脊髓损伤； 神经干

3、细胞移植； 磁共振成像； 大鼠    脊髓损伤(spinal cord injury,SCI) 后自身的修复能力非常有限,死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究改变了这一观点。NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞,是神经系统发育早期特定的细胞群体,它具备干细胞共有的特点，即能长久地保持增殖和分化能力1。随着分子影像学的发展,干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个突破点2。本研究利用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide,S

4、PIO) 标记NSCs,对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪,探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。    1  材料与方法    1.1  胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定3    取胚龄14 d SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,以1×105ml1种瓶,用DMEM/F12(11)无血清培养基内含bFGF 20 ng·ml1、EGF 20 ng·ml1、B27 20 ng·ml1培

5、养。每67 d换液、传代1次。    对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原,室温孵育30 min,吸干残液滴加1500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗,室温孵育1 h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。    1.2  NSCs的标记和染色    细胞传至第3代,

6、取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培养基中,37 振荡60 min,使SPIO终浓度为25 g·ml1,将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12 h完成标记。    NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7 d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤3遍,含2亚铁氰化钾的6盐酸溶液常温孵育30 min,显微镜下观察。    1.3  实验动物分组与

7、SCI模型的制作    66只成年雄性SD大鼠,体重250300 g,随机分为假损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法4制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠(30 g·L1)按40 mg·kg1腹腔注射麻醉,背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上,常规消毒,腰背部正中切口,逐层分开显露T8T10椎板,行T9全椎板切除,显露硬脊膜,钳夹固定T8及T10棘突,用10.0    g的不锈钢棒(直径为2.5 mm)

8、沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落,打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上,后者将打击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开打击物,逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2 ml,以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染,每天1次,持续3 d。注意保温,分笼饲养,自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩协助排尿,直至建立反射性排尿。    1.4&#

9、160; 细胞移植    将第3代悬浮培养的NSCs悬液用台式离心机离心5 min(1 000 r·min1),将细胞团以少量培养液吹匀,细胞计数为105l1。C组动物SCI后9 d于损伤节段下0.5 cm处用5 l微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中,注入2 l NSCs悬液,逐层缝合切口。    1.5  运动功能评分    BBB评分5为总分21分的运动功能评分,考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置,表示SCI后

10、大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观,易于掌握,与脊髓功能恢复有极好的一致性。分别在动物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周进行盲法BBB评分,由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。将动物置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 min,记录动物后肢运动情况。    1.6  MR检查    于术后第1、3、5周分别行MR检查，扫描序列为T2WI。麻醉方法同前。    1.7  统计学处理    所有数据以x-±s表示,采用SPS

11、S 12.0统计软件处理,组间比较采用t 检验,P0.05表示差异有统计学意义。    2  结    果    2.1  NSCs的培养和鉴定情况    图1  培养7d时NSCs于无血清培养基中    形成的神经球  ×200    2.2  普鲁士蓝染色结果    显示100的NSCs胞质内有细小的蓝色氧化铁颗粒（图3，见封二）。    2.3  运动功能评分