米帕明对谷氨酸损伤中枢神经细胞的保护作用

1、米帕明对谷氨酸损伤中枢神经细胞的保护作用(1)                               作者：许勇 姬汴生 石乐鸣 刘红 张贵卿  【关键词】  米帕     【摘要】    目的 

2、0;  研究米帕明(Imi)对谷氨酸损伤培养大鼠皮层神经细胞的保护作用。方法    分离培养15胎龄的大鼠神经细胞，加入谷氨酸(Glu)，观察谷氨酸对神经细胞的损伤作用及米帕明的保护作用。结果    加入谷氨酸后，神经细胞出现明显损伤性变化，死亡率升高，培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)含量增加，细胞匀浆中丙二醛(MDA)生成增加，超氧化物歧化酶(SOD)含量明显减少。Imi能不同程度地减轻上述损伤性变化。结论    I对谷氨酸所致的神经细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与钙拮

3、抗作用有关。     【关键词】    米帕明；谷氨酸；大脑皮层神经细胞；细胞培养     【bstract】    Objective    To study the protective effects of imipramine (Imi) on glutamate-induced neurotoxicity in cultured rat cerebral cortical neurons.ethods   

4、 Cortical neurons of fetal of rat were cultured in vitro.The protective effects of Imi  on glutamate-induced neurotoxicity were  obserced.esults    Exposure of rat fetus cerebral cells to Glu medium developed a neurotoxicity expressed in the increase of LDH leakage and NO,MD

5、A content and the decrease of activity of SOD,as well as the development of morphological injury.Imi protected neurons against above damage significantly.onclusion    The results suggest that Imi prevents the toxicity of Glu.And it maybe attribute to its effect of anticalcium.  &

6、#160;  【ey words】    imipramine,glutamate,cerebral cortical neurons,cell culture     缺血性脑血管病是临床常见疾病，对其发病机制人们提出了多种学说，如钙超载学说、兴奋毒性学说、自由基学说等，其中兴奋毒性学说早已为人们所重视。谷氨酸(glutamate,Glu)是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸，而几乎所有的神经细胞都有谷氨酸受体，因此任何引起胞外谷氨酸浓度异常增高的病理变化均会产生兴奋毒性。有研究发现，米帕明(，）具有钙拮抗作用，对兔基底

7、动脉有选择性舒张作用，因此考虑该药可能有脑保护作用。本研究利用培养大鼠皮层神经细胞，建立谷氨酸损伤模型，观察谷氨酸对神经细胞的损伤作用及研究I是否具有保护作用，并探讨其可能的作用机制。         材料与方法         材料    Wistar大鼠，孕15，由河南省实验动物中心提供。盐酸米帕明、多聚-赖氨酸(相对分子量为150 000 ）、谷氨酸、噻唑兰（MTT)均为Sigma公司产品；DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清均为Gibco

8、公司产品；盐酸阿糖胞苷为上海华联制药有限公司产品，批号990901；乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均为南京建成生物工程研究产品；总蛋白试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。其余试剂均为市售分析纯。HERA cell二氧化碳培养箱(德国GmbH公司)；SW-型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司）；BH-型倒置显微镜(日本Olympus Optical公司)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；DG5031型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。         方法 

9、0;       胚胎大鼠大脑皮质神经细胞培养：孕15 istar大鼠腹腔注射水合氯醛350麻醉，无菌条件下剖腹取出胎鼠，开颅取出大脑皮层放入预冷的DMEM培养基中，剔除软脑膜和血管，将脑组织移入含血清的DMEM培养基(含10%胎牛血清和10%马血清)的小烧杯中，用细口吸管反复轻轻吹打成细胞悬液，以200目不锈钢筛网过滤，并将滤液细胞数调至1×个，接种于经0.01%多聚-赖氨酸过夜处理的细胞培养板中(24孔板接种1孔，96孔板接种0.1孔)，置37、CO培养箱中培养。次日待细胞贴壁后换液1次并去除死细胞，以后每3 d换液1次。细胞培养

10、至第6天时，加入终浓度10阿糖胞苷以抑制非神经细胞的生长，18后换新的DMEM培养基继续培养。         Glu对神经细胞的损伤，：取培养12的神经细胞，吸去原培养液，用无arlie液(-）：aCl 143，l .，.，.，葡萄糖5.6，.，.洗2遍，每孔加入含Glu终浓度5×的无Marlie液1(24孔板)、.（孔板)，15后用DMEM培养基洗去Glu,再换用无血清的DMEM培养基，置37、培养箱中继续培养24。正常对照组不加G，其余处理同上。给药组在损伤处理前24及处理过程中均加入不同浓度的I。  

11、60;      MTT微量自动比色：lu损伤细胞后24，用MTT染色法测定细胞存活率。96孔细胞培养板于终止培养前每孔加入10 （终浓度为0.5L)，继续培养4 h后，吸去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100溶解甲肷结晶，待其充分溶解后，用酶标仪测其OD值，检测波长为570。细胞存活率(%)=值/对照组OD值×100%。         LDH和NO的测定：细胞经损伤处理后，收集培养上清液，按文献方法，参照试剂盒说明书测定培养液中LDH活性、NO含量。   &

12、#160;     神经细胞SOD和MDA的测定：细胞经损伤处理后，去除原培养液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1LPBS和.( .），再加入50 1%Triton-100，将24孔培养板置振荡器振荡1 使细胞溶解，加入100H3PO4以沉淀蛋白，100 000×于4离心1，取上清液，按试剂盒说明书测定SOD活力和MDA含量。蛋白质定量用双缩脲法。     表1    米帕明对Glu引起的神经（略）     表2    米帕明对Glu损伤

13、神经细胞（略）         讨论     Glu是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸，在维持神经细胞正常信号传导中起着重要的作用。但Glu大量释放，激活G受体，继而引起一系列病理反应，导致神经细胞变性坏死。研究表明，脑缺血时细胞膜通透性增高，G释放增加、摄取减少，G浓度升高，过量G作用于NMDA受体使之门控的离子通道开放，引起K大量外流，C、内流，胞内钙超载。细胞内C浓度升高是神经元损伤的机制之一，其后果是多方面的，除可激活一系列C依赖性酶，包括蛋白激酶C(PKC)、一氧化氮合酶(NOS)、核酸内切

14、酶(endonuclease)、磷脂酶A2(PLA2)等，触发花生四烯酸代谢瀑布、黄嘌呤氧化酶系活化产生自由基，造成细胞损害外，尚可由激活NOS引起NO的继发性损伤。神经细胞和胶质细胞的细胞膜上存在谷氨酸胱氨酸转运体(glutamate/cystine transporter,又称Xc antiporter system)，其作用是将胞内Clu转运出胞，同时将胱氨酸胞外转运入胞。胱氨酸在胞内还原为半胱氨酸(Cys)，后者是谷胱甘肽(GSH)的合成原料，也是其合成的限速因素。当细胞外Glu过多时可抑制谷氨酸胱氨酸转运体的功能，使胱氨酸入胞减少，GSH合成减少。GSH是脑内重要的活性氧清除剂，故胞

15、外Glu过多使细胞内氧自由基(OFR)堆积，从而对细胞产生毒性作用。OFR可以抑制Glu载体的功能，加剧胞外Glu堆积，增强Glu的毒性作用，使活性氧成分更趋增多，形成恶性循环。本实验显示，培养的神经细胞受到Glu损伤后，细胞死亡率、LDH漏出率升高，NO和膜脂质过氧化产物MDA生成增多，SOD活性下降。Imi能减少NO、生成，降低LDH漏出率和细胞死亡率，提高SOD活性，表现出较强的脑保护作用。神经细胞缺血性损伤与C信号转导异常导致胞内C浓度升高密切相关，细胞C信号转导异常是神经细胞变性的“最后共同通道”。兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤作用总是伴随着钙超载现象。因此我们认为I对Glu引起的大鼠

16、神经细胞损伤的保护作用可能与其钙拮抗作用有关。     参    考    文    献     宋秀媛，可君，张贵卿，等米帕明对兔离体基底动脉的作用中国药理学报，1992，（）：     Dildy J,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Cain dissociated brain cellsBrain Re

17、s,1999,499：     oh JY,Goldberg MP,Hartley DM,et al.Non- receptor mediated neurotoxicity in cortical culture Neurosci,1993,13(5):496     amura Y,Sato Y,Yokota T,et al.If enprodil prevents glutamate cytotoxicity via polyamine modulatory sites of N-spartate receptors in cu

18、ltued cortical neurons Pharmacol Exp Ther,1993，265(2):1017     孙东旭，张莉，陈学清体外细胞增殖和细胞毒试验见：朱立平，陈学清主编免疫学常用实验方法北京：人民军医出版社，2000     olh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in culture by lactate dehydrogenase efflux assayJ Neurosci Med,1987，5(5):83     eller JN,Kindy MS,Holtsberg FW,et al.Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury:suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation,and mitochondrial dysfunctionNeurosci,1998，18(2):687 &