真菌DNA提取方法

1、一、SDS法基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc,0c放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。1、试剂(1)提取缓冲液Tris-HCl100mmol/L(pH8.0)EDTA50mmol/L(pH8.0)NaCl500mmol/L灭菌后加伊疏基乙醇至10mmol/L(2)裂解液20%SDS(3)高盐溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)异丙醇(6)灭菌ddH2O或TE2、仪器离心机，恒温水浴，台式高速离心机，电泳装置3、实验程序(1)、离心菌体，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈

2、钢勺转移粉末到加有500dL提取液的离心管中，轻轻混匀。(2)、向管中加入50dL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65c保温10min,并不时摇动。(3)、力口入150dL5mol/LKAc,混匀，置冰上20-30min。(4)、4c,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20C沉淀30min。(5)、12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。(6)、加入1/10体积的RNaseA,37c保温20min,除去RNA。(7)、C:I抽提后，力口2V乙醇，-20C

3、沉淀30min。12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。(8)、用400dL70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2。或TE溶解DNA。(9)、电泳检测完整性。二、lysedcellsdirectlybyphenol(一)、试剂：1、STEBuffer(100mMNaCl,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)2、TEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)(二)、实验程序1、。离心菌体2、4003STEBuffer(100mMNaCl,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)洗2遍3、8000gfor2min4、T

4、hepelletswereresuspendedin200llTEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)5、50mgof425-600pmsize-fractionatedglassbeads(Sigma)wereaddedtothecellsuspension.6、100Tris-saturatedphenol(pH8.0)wasaddedtothesetubes,followedbyavortex-mixingstepof120-200stolysecells.7、13000gfor5minat4Ctoseparatetheaqueousphasefromth

5、eorganicphase.8、160upperaqueousphasewastransferredtoaclean1.5mltube.9、40dTEbufferwasaddedtomake200andmixedwith100chloroform10、centrifugedfor5minat13000gat4C11、Lysatewaspurifiedbychloroformextractionuntilawhiteinterfacewasnolongerpresent;thisproceduremighthavetoberepeatedtwotothreetimes.12、160upperaq

6、ueousphasewastransferredtoaclean1.5mltube.13、40llTEand5RNase(at10mg/ml)wereaddedandincubatedat37Cfor10mintodigestRNA.14、Then100plchloroformwasaddedtothetube,mixedwellandcentrifugedfor5minat13000gat4C.15、150upperaqueousphasewastransferredtoaclean1.5mltube.16、TheaqueousphasecontainedpurifiedDNAandwasd

7、irectlyusedforthesubsequentexperimentsorstoredat-20C.三、蜗牛酶破壁法(一)、试剂：1、500(PBS(0.01mol/LNa2HPO4和NaH2PO4,pH7.0,0.15mol/LNaCl)2、蜗牛酶溶液中(0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4,0.25mol/LMgC12用0.22师细菌滤膜过滤除菌)3、裂解液(2%TritonX-100,1%SDS,0.1mol/LNaCl,10mmol/LT、Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA)4、5mol/LKAc(pH8.9)(二)、实验程序1、离心菌体，沉淀中加入500LP

8、BS(0.01mol/LNa2HPO4和NaH2PO4,pH7.0,0.15mol/LNaCl)重悬,12000r/min离心2min;弃上清，重复悬浮一次2、沉淀溶于100人含20mg/mL的蜗牛酶溶液中(0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4,0.25mol/LMgC12用0.22师细菌滤膜过滤除菌)3、45C作用2h4、力口100山裂解液(2%TritonX-100,1%SDS,0.1mol/LNaCl,10mmol/LT、Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA)5、-20c冷冻，然后室温震荡溶解，反复3次6、向悬浮液中加入150山5mol/LKAc(pH8.9)轻轻混匀7

9、、10000r/min离心5min;将上清转移到一新的1.5mL离心管中8、乙醇沉淀四、改良CTAB法1、取1.5mL菌液，12000rpm*2min,MQ洗2遍2、加入500lL5XCTAB（含1%3疏基乙醇），液氮中速冷30s,立即65C30s,反复3次3、加入1/3体积的玻璃珠，漩涡振荡器上高速振荡4min-5min4、65C保温20min,每隔10min摇匀1次5、加入等体积酚：氯仿:异戊醇（25:24:1,V/V/V）,12000r/min离心10min6、将上清液移入到新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1,V/V）,12000r/min离心10min。7、在上清中加入2

10、倍体积预冷的无水乙醇,-20c静置20min-30min,12000r/min离心10min。8、倒掉上清，加70%的酒精200L洗沉淀，室温干燥9、加入100LTE使DNA完全溶解10、加入RNaseA(10mg/mL),65C保温30min以上11、重复7-9,最后DNA溶于30LddH2O中。五、亚精胺对DNA进行纯化利用亚精胺对含多糖、多酚类物质较多的植物、真菌等材料的DNA进行纯化，以去除杂质，利于后续试验。1、加入400JTris-HCl(100mM8.0),溶解DNA2、400J亚精胺(5mM)振荡3、4C,放置15分钟4、4C,17000g,离心15分钟，弃上清5、力口400M

11、盐溶3夜110mMMgCl2、300mMNaCl2),400M异丙醇，振荡，室温放置15分钟。6、17000g,离心15分钟7、70%乙醇，轻摇，洗涤8、晾干后溶解。六、TRIzol1、离心菌体，MQ洗2遍2、液氮研磨3、力口1mlTRIzol每5-10*106Yeastcells,反复吹吸4、15-30C*5min5、0.2ml氯仿，混匀15sec,然后15-30C*2-3min6、12000g*15minat4C7、去除水相8、0.3ml无水乙醇沉淀中间相和有机相，颠倒混匀，15-30C*2-3min9、2000g*5minat4C10、去除苯酚-乙醇上清11、沉淀（含DNA）用1ml洗液（0.1M柠檬酸钠，10%乙醇）重悬，15-30C*30mi