第四章酶的提取与分离纯化分析

1、1第四章酶的提取与分离第四章酶的提取与分离纯化纯化2 第四章第四章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化l预处理预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。破碎（分离胞内产物）等。l初步纯化初步纯化（rough fractionation） （提取）：除（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。去与目的产物性质差异很大的杂质。l高度纯化高度纯化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去与产物性质相似的杂质。去与产物性质相似的杂质。l浓缩与干燥浓缩与干燥（concentration and desiccation）

2、（成品加工）（成品加工）: :使酶与溶剂分离的过程。使酶与溶剂分离的过程。3酶酶的纯化过程，约可分为的纯化过程，约可分为三三个阶段个阶段：(1) (1) 粗粗蛋白质蛋白质 (crude (crude protein): protein): 采样采样 均均质质打破细胞打破细胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐盐析析沉淀沉淀法；可法；可以粗略去除蛋白质以外的以粗略去除蛋白质以外的物质。物质。(2) (2) 部分纯化部分纯化 (partially purified): (partially purified): 初步的纯化，使用各钟初步的纯化，使用各钟 柱柱层层析法。析法。(3) (3) 均

3、均质酶质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶目标酶的的进进一步精制纯化，可用一步精制纯化，可用制备制备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。酶分离纯化不同阶段酶分离纯化不同阶段4第一节第一节 细胞破碎细胞破碎 第二节第二节 酶的提取酶的提取第三节第三节 沉淀分离沉淀分离 第四节第四节 离心分离离心分离第五节第五节 过滤与膜分离过滤与膜分离 第六节第六节 层析分离层析分离第七节第七节 电泳分离电泳分离 第八节第八节 萃取分离萃取分离第九节第九节 酶的结晶酶的结晶 第十节第十节 浓缩与干燥浓缩与干燥本章主要内容本章主要内容5 许多酶存在于细胞内。为了提取这许多酶存

4、在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。理。6细胞结构与酶分布71）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶促破碎）酶促破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机8l捣碎法捣碎法l研磨法研磨法l匀浆法匀浆法9l捣碎法捣碎法l研磨法研磨法l匀浆法匀浆法10l捣碎法捣碎法l研磨法研磨法l匀浆法匀浆法DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机11l温度差破碎法温度差破碎法l压力差破碎法压力差破碎法l超声波破碎法

5、超声波破碎法12l温度差破碎法温度差破碎法 高压冲击法高压冲击法l压力差破碎法压力差破碎法 突然降压法突然降压法 渗透压变化法：渗透压变化法：高渗高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中溶液或水中高压细胞破碎机高压细胞破碎机13l温度差破碎法温度差破碎法l压力差破碎法压力差破碎法l超声波破碎法超声波破碎法14 应用各种化学试剂与应用各种化学试剂与细胞膜细胞膜作用，使作用，使细胞膜结构改变或破坏。细胞膜结构改变或破坏。1 1）有机溶剂处理：）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。丙酮、丁醇、氯仿等。2 2）表面活性剂处

6、理：）表面活性剂处理：常用非离子型表面活常用非离子型表面活性剂，如性剂，如Triton X-100，Tween等。等。15l自溶自溶（autolysis）：）：细胞结构在本身具有的细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发各种水解酶作用下发 生溶解的现象生溶解的现象 溶菌酶：溶菌酶：革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌l外加酶外加酶 葡聚糖酶：葡聚糖酶：酵母酵母 几丁质酶：几丁质酶：霉菌霉菌 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶： 植物细胞壁植物细胞壁16 细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构 17机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法

7、压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使

8、加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理18 细胞细胞 声波声波 机械机械 渗透压渗透压 冻融冻融 l动植物动植物 + + + + + + +l革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 + + + + + + +l革兰氏阳性芽孢菌革兰氏阳性芽孢菌 + + + + + + +l酵母酵母 + + + + + + +l革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌 + - + + - + +l菌丝菌丝 - + - +- + - +l孢子孢子 - - - -19 1.1.直接测定破碎前后的细胞数直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电

9、子微粒计数器直接计数；破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.2.测定导电率测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.3.测定释放的蛋白质量或酶活力测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。算破碎率。 20 把酶从生物组织或细胞中以溶解状把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。尽量

10、少的杂质从原料中引入溶液。21 提取目标：提取目标： a. 将将目的酶最大限度地溶解出来。目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。保持生物活性。l注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，l一般一般采用低温下（采用低温下（0 0 1010）操作。操作。22提取原则提取原则la. 相似相溶。相似相溶。lb. 远离等电点的远离等电点的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。231 1、盐溶液提取、盐溶液提取2 2、酸溶液提取、酸溶液提取3 3、碱溶液提取、碱溶液提取4 4、有机溶剂提取、有机溶剂提取24大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度大多数蛋白

11、类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 25l用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶定性较好的酶l用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶性较好的酶26l有些酶与脂质结合或含有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。则可用有机溶剂提取。 27提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5mol/L0.5

12、mol/L的盐的盐溶液溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶解度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH2pH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶大，且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH8pH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶大且稳定性较好的酶有机溶剂提有机溶剂提取取可与水混溶的有机溶可与水混溶的有机溶剂剂用于提取那些与脂质结合牢固用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶或含有较多非极性基团的酶281 1、温度、温度 适当提高温度，可以提

13、高酶的溶解度。适当提高温度，可以提高酶的溶解度。2 2、pHpH值值 提取时提取时pH值应该避开酶的等电点。值应该避开酶的等电点。3 3、提取液的体积、提取液的体积 提取液的总量一般为原料体积的提取液的总量一般为原料体积的35倍。倍。29l通过改变某些条件或添加某些物质，使通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其它溶质分离的技术过程。其它溶质分离的技术过程。30在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法） 等电点沉淀等电点沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀

14、复合沉淀法复合沉淀法 选择性沉淀（热变性和酸碱变性）选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀31一、盐析沉淀法（改变离子强度）一、盐析沉淀法（改变离子强度） 1、基本原理（盐溶和盐析）、基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：产生两种现象： 1) 盐溶盐溶（salting insalting in） ： 低浓度低浓度的中性盐的中性盐增加增加蛋白质的溶解度。蛋白质的溶解度。 2) 盐析盐析（salting outsalting out） ： 高浓度高浓度的中性盐的中性盐降低降低蛋白质的溶解度。蛋白质的溶解度

15、。32硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度33 ： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 35l不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称称分段盐析分段盐析。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段

16、盐析36蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域 3738391）中性盐的选择）中性盐的选择 常用（常用（NH4）2SO4，其突出优点：，其突出优点： a. 溶解度大溶解度大 b. 分离效果好分离效果好 c. 不易引起变性不易引起变性 d. 价格便宜价格便宜2、盐析用盐、盐析用盐402) 盐浓度的表示盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示用饱和（溶解）度表示: 加入饱和硫酸铵的体积加入饱和硫酸铵的体积 饱和度饱和度 溶液的总体积溶液的总体积413) 调整盐浓度的方式调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液

17、体积不太大，而达到的盐浓适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。度又不太高时。 配制饱和硫酸铵溶液配制饱和硫酸铵溶液42b. 添加固体硫酸铵添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。达到的盐浓度又很高时。43调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表44l低饱和度：低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过一般终饱和度不超过4040。l高饱和度：高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1 1）固体硫酸

18、铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3 3）沉淀再溶解后可用超滤）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltrationultrafiltration） 、透析透析（dialysisdialysis）或层析或层析（chromatographychromatography）方法方法脱盐。脱盐。454 4、盐析的影响因素、盐析的影响因素1) 离子强度和种类离子强度和种类 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：IKSSs0loglogI I

19、：离子强度，：离子强度，I =1/2MZI =1/2MZ2 2,M,M：离子浓度（：离子浓度（mol/Lmol/L）, , Z Z：离子价数：离子价数S S：离子强度为：离子强度为I I时的蛋白质的溶解度（时的蛋白质的溶解度（g/Lg/L）S S0 0：离子强度为：离子强度为0 0时蛋白质的溶解度（时蛋白质的溶解度（g/Lg/L）KsKs：盐析系数，是与：盐析系数，是与蛋白质蛋白质和和盐种类盐种类有关的特性常数。有关的特性常数。 KsKs代表盐析效率代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，蛋白质溶解度降低的速度，K Ks s越大盐析效果越好。

20、越大盐析效果越好。 46 当温度一定时，当温度一定时，S S0 0对于某一溶质是常数，对于某一溶质是常数，用用表示，盐析方程式可改写为：表示，盐析方程式可改写为： log S = - Klog S = - Ks s I I 两种盐析法：两种盐析法：Ks分段盐析法分段盐析法 ：在一定的在一定的pH和温度条件下，和温度条件下，利用不同蛋白质利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分段盐析法分段盐析法 ：在一定离子强度下，通过改在一定离子强度下，通过改变溶液的变溶液的pH及温度的沉淀方法及温度的沉淀方法。47

21、2) 蛋白质浓度：蛋白质浓度： 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%2.5%3%3%最好。最好。 3) pH值：值：等电点处最易沉淀。等电点处最易沉淀。4) 温度的影响：温度的影响：l稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。l浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。48二、等电点沉淀二、等电点沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric pre

22、cipitation) 1. 原理原理l 蛋白质在等电点时溶解度最低蛋白质在等电点时溶解度最低l 不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法使用方法 单独单独使用使用较少，多与其它方法联合使用，因较少，多与其它方法联合使用，因蛋白蛋白质质在等电点时仍有一定的溶解度。在等电点时仍有一定的溶解度。49三、三、 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。同而使之分离的方法。l1. 沉淀机理沉淀机理l 降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数l 部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水l2. 常用有机

23、溶剂常用有机溶剂l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积甲醇，用量一般为酶液体积的的2 2倍左右，终浓度为倍左右，终浓度为70%70%。 503.优缺点：优缺点：优点优点：1）分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：缺点：1）容易引起蛋白质变性失活）容易引起蛋白质变性失活 2 2）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高 51l定义：定义：在酶液中加入某些物质，使其与酶在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。

24、分离。l常用复合沉淀剂：常用复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸烯酸52五、选择性变性沉淀法五、选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 热变性热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH变性变性 等电点沉淀法是等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。变性法中的一种变体。 有机溶剂变性有机溶剂变性 使那些对有机溶

25、剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。53沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的调节溶液

26、的pHpH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀选择性变性沉淀选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉选择一定的条件使酶液中存在的

27、某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离54第四节第四节 离心分离离心分离一、离心机的选择一、离心机的选择 按离心机最大转速的不同，分为：按离心机最大转速的不同，分为： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速55名称名称 转速转速(r/min)(r/min) 注意事项注意事项 低速离心机低速离心机 80008000 常温，注意样品热变性和常温，注意样品热变性和离心管平衡离心管平衡 高速离心机高速离心机 1000025000冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 超速离心机超速离心机 25000冷冻

28、真空系统（减少空冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），气阻力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡 离心机的种类离心机的种类 56l材质：玻璃，塑料材质：玻璃，塑料l强度：和离心速度强度：和离心速度相配相配l大小：和转子配套大小：和转子配套l高速超速管要加盖高速超速管要加盖57二、离心方法的选用二、离心方法的选用 差速离心法差速离心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度离心密度梯度离心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度离心等密度梯度离心581差速离心差速离心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的离心速度和离心

29、时间，使沉降速采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法度不同的颗粒分批分离的方法。特点：特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：优点：操作简单操作简单 。缺点：缺点：1）分离效果较差，分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。不能一次得到纯颗粒。 2）壁效应严重。）壁效应严重。 3 3）沉降的颗粒受到挤压）沉降的颗粒受到挤压。59 差速离心分离示意图差速离心分离示意图 （a a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液 （b b）（）（e e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况 602密度梯度离心密度梯度离心 （dens

30、ity gradient centrifugationdensity gradient centrifugation） 样品在样品在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使沉中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。分离方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗糖溶液。溶液。61特点：特点：区带内的液相介质密度小于样品物质区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质物质。62 密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图 （a a）离心前）离心前 （

31、b b）离心后）离心后 633. 等密度梯度离心等密度梯度离心 又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心 （sedimentation sedimentation equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根据根据颗粒的密度不同颗粒的密度不同而进行分离。而进行分离。 离心时，在离心介质的密度梯度范围内，离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。区带。 64常用常用氯化铯氯化铯（Cs

32、ClCsCl）作为梯度介质。）作为梯度介质。特点：特点： 介质的密度梯度范围包括所有待分离介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。的物质。65 等密度梯度离心示意图等密度梯度离心示意图 （a a）离心前；）离心前； （b b）离心后）离心后 66密度梯度离心密度梯度离心等密度梯度离心等密度梯度离心梯度梯度介质介质通常用蔗糖通常用蔗糖通常用通常用CsCl离心离心条件条件在最前的沉降物质达在最前的沉降物质达到管底前停止，短时到管底前停止，短时间，低速度间，低速度使各组分沉降到其平衡使各组分沉降到其平衡的密度区，

33、长时间，高的密度区，长时间，高速度速度分离分离依据依据密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系数不同数不同沉降系数相近，但密度沉降系数相近，但密度不同不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点沉降速度离心和沉降平衡离心的特点67三、离心条件的确定三、离心条件的确定1. 1. 离心力离心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N为离心机为离心机每分钟转数每分钟转数 （r/min ）；）； Fc通常以相对离心力通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力）表示，即离心力F的大小相的大小相当于地球引力（重力常数当于地球引力

34、（重力常数g）的多少倍。）的多少倍。一般一般用用g g（或数字（或数字 g g）表示。）表示。68RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 69 通常：通常：低速离心以低速离心以每分钟的转数每分钟的转数表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。高速离心（超速），常以高速离心（超速），常以相对离心力相对离心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000g。 两者可换算或查测算图。两者可换算或查测算图。

35、702. 沉降系数沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于许多生物大分子的由于许多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定义义10 10 13 s 为一个沉降单位，为一个沉降单位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系，蛋白质的沉降系数一般在数一般在1 200之间。之间。 71过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质

36、将不同大小、不将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。高分子膜等，可以根据需要选用。72过滤过滤非膜过滤：非膜过滤：采用高分子膜以采用高分子膜以外的物质作为过滤介质外的物质作为过滤介质 膜过滤：膜过滤：采用各种高分子膜为采用各种高分子膜为过滤介质过滤介质 73 常压过滤：液位差为推动力常压过滤：液位差为推动力粗滤粗滤 加压过滤：压力泵或压缩空气加压过滤：压力泵或压缩空气 减压过滤：过滤介质下方抽真空减

37、压过滤：过滤介质下方抽真空微滤微滤74吊袋卸料离心机吊袋卸料离心机 757677二、膜分离技术二、膜分离技术 借助一定孔径的高分子薄膜，将借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。进行分离的技术。78（一）加压膜分离（一）加压膜分离 根据所截留物质颗粒大小的不同，分为根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：截留颗粒截留颗粒直径直径操作压力操作压力应用应用微滤微滤0.22 m0.1MPa除菌除菌超滤超滤20 0.2 m 0.1 0.7MPa 分离病毒及分离病毒及生物大分子生物大分子反渗透反渗透 2m 2m酵母、霉菌、动物酵母、霉菌、动

38、物细胞、植物细胞、细胞、植物细胞、固形物等固形物等滤纸、滤布、纤滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧维多孔陶瓷、烧结金属等结金属等微滤微滤0.20.22m2m细菌、灰尘等细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶微滤膜、微孔陶瓷瓷超滤超滤20200.2m0.2m病毒、生物大分子病毒、生物大分子等等超滤膜超滤膜反渗反渗透透 20 20生物小分子、盐、生物小分子、盐、离子离子反渗透膜反渗透膜91 层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19031903年俄国植年俄国植物学家物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。发现并命名的。将植物色素溶液通过装有将植物色素溶液通过装有CaCOCaCO

39、3 3吸附剂吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。被分开。 92一、吸附层析一、吸附层析（adsorption adsorption chromatography） 1、原理、原理 利用吸附剂对不同组分的吸附力不同进行利用吸附剂对不同组分的吸附力不同进行分离。分离。931 1、原理、原理 吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附物质的性质有关。 吸附层析的关键：吸附层析的关键：吸附剂和洗脱剂吸附剂和洗脱剂的选择的选择。一、吸附层析一、吸附层

40、析94l溶剂洗脱法溶剂洗脱法l置换洗脱法置换洗脱法l前缘洗脱法前缘洗脱法一、吸附层析一、吸附层析953.3.吸附剂吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。分离物质的极性官能团作用。1 1）吸附剂的选择：）吸附剂的选择：根据吸附能力强弱分为：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭强吸附剂：氧化铝、活性炭一、吸附层析一、吸附层析96吸附剂的选择根据相似相溶原则：吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸

41、附剂易吸附极性强的物质极性强的吸附剂易吸附极性强的物质非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。 但为了便于解吸附，对于极性强的物但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。 一、吸附层析一、吸附层析3、吸附剂、吸附剂974、洗脱剂、洗脱剂要求：要求： 粘度小，纯度高，粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分所要分离的成分, ,易与目标分子分离。易与目标分子分离。选择：选择： 具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂

42、。生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。一、吸附层析一、吸附层析985、应用、应用 分离纯化生物大分子分离纯化生物大分子一、吸附层析一、吸附层析99l分配层析是利用各组分在两相中的分配分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。系数不同，而使各组分分离的方法。l分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数，用定后，分配系数是一常数，用K表示。表示。100在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持

43、物在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为相流动，称为流动相流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。在两相之间进行连续的动态分配。二、分配层析二、分配层析101l固定相：滤纸纤维的结合水固定相：滤纸纤维的结合水l流动相：与水不相混溶

44、或部分混溶的有流动相：与水不相混溶或部分混溶的有机溶剂机溶剂二、分配层析二、分配层析102二、分配层析二、分配层析103三、离子交换层析三、离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 原理原理: :根据待分离物质带电性质不同的分离根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。纯化方法。1041、离子交换剂、离子交换剂： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。 如羧甲基纤维素离子交换剂组成如羧甲基纤维素离子交换剂组成 纤维素纤维素O OCHCH2 2COOCOO- -NaNa+ + 载体载体 电荷基团电荷基团 反离子反

45、离子三、离子交换层析三、离子交换层析105 化学原料合成化学原料合成 ：树脂类物质：树脂类物质 载体载体 天然材料制成：天然材料制成： cellulose cellulose sephadex sepharose 阳离子交换剂阳离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（）电荷基团电荷基团 阴离子交换剂阴离子交换剂: 电荷基团（）电荷基团（）, 反离子（）反离子（） 如：如：DEAE-纤维素，纤维素， CM-Sepharose三、离子交换层析三、离子交换层析106离子交换剂离子交换剂-带有电荷基团的带有电荷基团的不溶性不溶性载体载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH

46、3ClCl- -载体载体Diethylaminoethyl(DEAE) 阴离子交换剂阴离子交换剂(可吸附可吸附带负电的蛋白质带负电的蛋白质) 阳离子交换剂阳离子交换剂(可吸附可吸附带正电的蛋白质带正电的蛋白质)107l阴离子交换剂：阴离子交换剂：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基l阳离子交换剂：阳离子交换剂：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CH2COO l磺丙基磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3三、离子交换层析三、离子交换层析108类型类型说明说明功能基功能基反离

47、子反离子DEAE-Sephadex DEAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50弱碱性阴离弱碱性阴离子交换剂子交换剂二乙氨基己基二乙氨基己基氯氯QAE-Sephadex QAE-Sephadex A-25 A-25 ，A-50A-50强碱性阴离强碱性阴离子交换剂子交换剂二乙氨基己二乙氨基己基基2-2-羟丙基羟丙基氯氯CM-Sephadex CM-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50弱酸性阳离弱酸性阳离子交换剂子交换剂羧甲基羧甲基钠钠SP-Sephadex SP-Sephadex C-25 C-25 ，C-50C-50强酸性阳离强酸性阳离子交换剂子交换剂

48、磺丙基磺丙基钠钠109 离子交换剂的选择离子交换剂的选择a. 强、弱离子交换剂的选择：强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的强型：适用的pH范围广，范围广，制备无离子水制备无离子水 弱型：适用的弱型：适用的pH范围窄，范围窄，分离生物大分子物质分离生物大分子物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性酶的稳定性若若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂三、离子交换层析三、离子交换层析1102、蛋白蛋白质质的的电荷性电荷性质质PrNH3+COOHPrNH3+COO- -PrNH2COO- -OH- -H +OH- -H +兼性离子pH

49、=pI阳离子pHpI三、离子交换层析三、离子交换层析111pH 值如何影响蛋白质的电荷数值如何影响蛋白质的电荷数24681012140系统系统 pH+ 蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷 蛋白蛋白质带负电质带负电荷荷等等电点电点-112 3、实验设计原、实验设计原理理 利用不同的蛋白利用不同的蛋白质质分子在溶液中所分子在溶液中所带电带电荷荷不同，因而不同，因而与离子交换剂与离子交换剂有不同吸附力有不同吸附力而而分离。分离。pH6.0pI 6.0 蛋白蛋白质带质带正正电电pI 6.0 蛋白蛋白质带负电质带负电1134、 阴离子交换剂分离蛋白质阴离子交换剂分离蛋白质的的过程过程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸

50、附分离结束分离结束再生再生+低盐低盐高盐高盐利用不同利用不同盐浓度将盐浓度将不同蛋白不同蛋白质质洗洗脱下脱下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-1145、 操作操作 平衡平衡上样上样 平衡平衡洗脱洗脱再生再生1）上样：）上样：上样体积不十分严格。上样体积不十分严格。2）洗脱）洗脱: 增加溶液的离子强度增加溶液的离子强度 梯度洗脱法梯度洗脱法 改变溶液的改变溶液的pH值值 3）再生：）再生：用用0.5mol/LNaOH和和0.5mol/L NaCl混混合溶液或合溶液或0.5mol/L HCl处理。处理。三、离

51、子交换层析三、离子交换层析1151161、基本原理、基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。后流出层析柱。117凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数KaKa表示：表示： Ve-Vo Ka= ViVo外水体积外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（的体积（ml）Vi内水体积内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔

52、体积的总和（孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）118凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰. K. Ka a=0=0时时, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。先流出。.其它组分其它组分0K0Ka a1,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。因分子大小而改变洗脱峰的位置。KaKa小的先流小的先流出，出，KaKa大的后流出。大的后流出。 . K. Ka a=1=1时时, ,即

53、即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。最后流出。119 分配系数分配系数Ka的意义：的意义：1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。可定量地衡量各组分的流出顺序。2) 判断分离效果，判断分离效果，Ka差异大，分离效果好，差异大，分离效果好， Ka差异小，分离效果差。差异小，分离效果差。四、凝胶层析四、凝胶层析120LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测LogM=kLogM=k1 1-k-k2 2VeVe（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积） 先测得几种标先测得几种标准蛋白质的准蛋白质的VeVe，并，并

54、以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得一直线，作图得一直线，再测出待测样品的再测出待测样品的VeVe，查标准曲线即，查标准曲线即可确定分子量。可确定分子量。蛋白质的洗脱体积与其分子量有关蛋白质的洗脱体积与其分子量有关1212 2、凝胶的选择与处理、凝胶的选择与处理 1)1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex 型号型号 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G-200 G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，

55、分数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。离范围越广。四、凝胶层析四、凝胶层析122凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小/m/m 溶胀体积溶胀体积/(ml/g)/(ml/g) 分离范围（分离范围（MrMr） Sephadex G-10Sephadex G-10 Sephadex G-15Sephadex G-15 Sephadex G-25Sephadex G-25 Sephadex G-50Sephadex G-50 Sephadex G-75Sephadex G-75 Sephadex G-100Sephadex G-100 Sephadex G-150Sephadex G-150Se

56、phadex G-200Sephadex G-2004 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2 23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.010103 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 43.03.010103 38.08.010104 4 4.04

57、.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 葡聚糖凝胶层析介质的有关参数葡聚糖凝胶层析介质的有关参数 1232 2）琼脂糖凝胶（）琼脂糖凝胶（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美国）美国） 依靠糖链之间的次级键维持网状依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。密集。四、凝胶层析四、凝胶层析1

58、24型号型号 使用范围（蛋白质的分子量）使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖含琼脂糖（） 6B6BSepharose 4BSepharose 4B 2B 2B10104 43 310106 610105 53 310107 710106 610108 8 6 64 4 2 2 6B6BSepharose CL 4BSepharose CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m0.5m Bio-Gel A 1.5mBio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m101050050010103 31010150015001010500050004

59、04015000150001001005000050000 1000 1000150000150000 10108 86 64 42 2 1 1 SepharoseSepharose及及Bio-gel A Bio-gel A 型号型号 1253 3）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名为商品名为Bio-Gel P,Bio-Gel P,型号从型号从Bio-Gel Bio-Gel P P2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔径也越大。值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰以丙烯酰胺为单体，以甲

60、叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。四、凝胶层析四、凝胶层析1263、操作：、操作：1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。凝胶介质。 将干胶悬浮于将干胶悬浮于510倍的倍的蒸馏水中蒸馏水中 ，充分，充分溶胀，抽气，装柱。溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择）柱的选择 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速但影响流速。四、凝胶层析四、凝胶层析1273）加样）加样 体积不能过多，不超过床体积的体积不能过多，不超过床体积的30，通常可在，通常可在1