MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

1、MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、考前须知-四、实验所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管没有的话，可用培养瓶替代参加20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打假设干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内

2、。将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2 对于大包装，可按上述方法称取一局部溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。考前须知：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量

3、分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改进MTT方法，中国医药工业杂志，1993，2410：455-457，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。个人觉得其溶解

4、的能力不如DMSO强该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。五、MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。细胞详细计数方法请参照 biobars 中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞到达5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的25cm2为例，1)        细胞密度在长到约80%

5、90%下列图所示为80%90%密度时细胞的大致状态，消化离心收集后，将上清去掉，参加3ml培养基使其混匀。2)        另取一支新的15ml无菌离心管为下一步接种96孔板用，装入约9ml培养基. 3)        从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 参加上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞见下列图；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按5

6、0ul计算。 4)        细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以相当于细胞悬液密度为2×104/ml，细胞毒性实验每孔500010000个相当于细胞悬液密度为5×104/ml。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比方：生长较快的细胞密度可略小。 2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔参加100ul, 这样待测细胞的密度为500010000/孔边缘孔用无菌PBS填充。l     

7、0;   注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复屡次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。-3.       将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底96孔平底板,参加浓度梯度的药物,原那么上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否那么难以反响真实情况。下列图可做为96孔板的的参考步局。 l  &

8、#160;    对于加药，有人直接将药物按不同体积参加到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉可以用排枪吸走再参加100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一局部后立即加样，防止由于96孔板枯燥引起细胞死亡。 4.       5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下列图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5

9、.       每孔参加10ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。 6.       终止培养，准备溶解结晶。  l         溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1)        M

10、TT参加培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2)        每孔参加150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 l     &

11、#160;   另一种方法，用三联溶解液见上面MTT甲瓒溶解液1)        MTT参加培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔参加100ul溶解液。该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。2)        放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如

12、果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。 在实际的操作过程中，往往为了等待46小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，参加溶解液后过夜再测对OD值根本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以参加溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。7、同时设置调零孔培养基、MTT、二甲基亚砜，对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜。 MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahia

13、zo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。二、MTT法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT主要有两个用途1药物也包括其他处理方式如放射线照射对体外培养的细胞毒性的测定；2细胞增殖及细胞活性测定。三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒Formazan并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490n

14、m波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值OD值，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强如果是测药物毒性，那么表示药物毒性越小。四、实验所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管没有的话，可用培养瓶替代参加20ml PBS，从中先吸取500-

15、1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打假设干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2对于大包装，可按上述方法称取一局部溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。考前须知：l在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。l配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感lMTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周

16、内个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。lMTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2MTT甲瓒溶解液2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性

17、的改进MTT方法，中国医药工业杂志，1993，2410：455-457，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。个人觉得其溶解的能力不如DMSO强该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。五、MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。 细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞到达5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的25c

18、m2为例，1)细胞密度在长到约80%90%下列图所示为80%90%密度时细胞的大致状态，消化离心收集后，将上清去掉，参加3ml培养基使其混匀。2)另取一支新的15ml无菌离心管为下一步接种96孔板用，装入约9ml培养基.3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 参加上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞见下列图；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以相当于细胞悬液密度为2×104/ml，细

19、胞毒性实验每孔500010000个相当于细胞悬液密度为5×104/ml。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比方：生长较快的细胞密度可略小。2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔参加100ul, 这样待测细胞的密度为500010000/孔边缘孔用无菌PBS填充。l注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复屡次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底96孔平底板,参加浓度梯度的药物,原那么上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我

20、们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否那么难以反响真实情况。下列图可做为96孔板的的参考步局。l对于加药，有人直接将药物按不同体积参加到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉可以用排枪吸走再参加100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一局部后立即加样，防止由于96孔板枯燥引起细胞死亡。4.5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下列图为一

21、典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5.每孔参加10ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。 6. 终止培养，准备溶解结晶。l 溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1) MTT参加培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索

22、一下再决定。2) 每孔参加150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。l 另一种方法，用三联溶解液见上面MTT甲瓒溶解液1) MTT参加培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔参加100ul溶解液。该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。2) 放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大

23、较多，溶解的时间会长一些。在实际的操作过程中，往往为了等待46小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，参加溶解液后过夜再测对OD值根本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以参加溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。7、同时设置调零孔培养基、MTT、二甲基亚砜，对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜。六、MTT结果分析关于如何计算IC50 1、改进寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反响率之和Pm:

24、最大阳性反响率Pn:最小阳性反响率举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下药物浓度ug/ml100502512.56.253.1250OD均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中的最大最小阳性反响率就是最大最小抑制率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：药物浓度ug/ml100502512.56.253.125抑制率0.8690.8490.6160.3910.2820.135代入计算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.84

25、9+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186该药物的IC50值为45.186ug/ml    -/ MTT所有问题大汇总-实验前应明确的问题1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接

26、种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否那么细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比拟大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否那么，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了到了平台期那个时间点应该就是最好的时间点因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显。4. 培养时间。200ul的培养液对于10的45次

27、方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组参加不同浓度的药物。8. 防止血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验

28、本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内剩余培养液。实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔参加100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。2. 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底96孔平底板，参加浓度梯度的药物，原那么上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否那么难以反响真实情况3. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4. 每孔参加20ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。6. 每孔参加1