西安地域汉族亚甲基四氢叶酸还原酶的两种基因多态性

1、西安地域汉族亚甲基四氢叶酸还原酶的两种基因多态性【关键词】聚酶链反映AbstractAIM:TofindouttwogeneticpolymorphismsofMTHFRamongtheHanpeopleinXianarea.METHODS:PCRRFLPtechniquewasusedtodetectC677TandA1298CpolymorphismsofMTHFR.RESULTS:Theallelefrequenciesof677Tand1298Cwere45%and20%,respectivelyandthehomozygotefrequenciesof677TTand1298CCwe

2、re18%and3%,respectively.ThefrequenceofcombinedheterozygosityfortheC677TandA1298Cmutationswas21%.CONCLUSION:ThegeneticpolymorphismofMTHFRfromourstudyisdifferentfromthosepreviouslyreportedbyothers,whichmayduetodifferencesbetweenpopulations.KeywordsRFLP;MTHFR;genes,polymorphism【摘要】目的：了解西安地域汉族人MTHFR基因C6

3、77T和A1298C两个位点的遗传多态性.方式：应用聚合酶链反映限制性片段长度多态性(PCRRFLP)调查西安地域96个汉族人的基因型散布.结果：677T等位基因的散布频率为45%,TT纯合子占18%；1298c等位基因的散布频率为20%.CC合子占3%；双杂合子677CT,1298AC占21%.结论：调查显示这两个位点的遗传多态性与文献报导不同，可能具有群体不同性.【关键词】限制性片段长度多态性；亚甲基四氢叶酸还原酶;基因，聚酶链反映0引言亚甲基四氢叶酸还原酶（5,lOmethylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR）是人体内同型半胱氨酸（homocystei

4、ne,Hey）复甲基化的关键酶.由于MTHFR基因缺点，造成该酶活性障碍，会阻碍体内同型半胱氨酸的正常代谢，使其血液浓度增高1.而大量研究说明，体内Hey浓度每升高5Umol・L-l,男、女患冠心病的风险就会别离增加和倍2.除此之外，高浓度的Hey仍是其他动静脉血栓形成及神经管缺点的致患因素3,4.通过十余年的研究,现己发觉人类MTHFR的15种点突变类型5.其中最多见最重要的一个是第677位C-T突变.此位点多态性不仅能够引发酶活性下降,还与MTHFR的热灵敏性有关6,是上述疾病的易感因子.Al298c是该基因的另一个常见多态位点，此点突变也阻碍酶的活性，但与热灵敏性无

5、关4.不同国家和地域的多项研究说明，人群中MTHFR基因C677T多态和A1298C多态的散布存在群体不同，这种不同可能造成人群对疾病的易感性不同.本研究咱们应用PCRRFLP技术检测这两处突变，了解西安地域汉族人MTHFR基因的分子遗传学特点.1对象和方式对象200111/200206间选取96（男58,女38）例,年龄3778（平均岁.互无血缘关系的汉族健康者，在西安地域长期居住（20a以上）.材料DNA抽提试剂:STE液（10mmol・L-1TrisHCL,pH;100mmol・L-lNaCl,1mmol・L-l乙二胺四乙

6、酸二钠（EDTA）,100mL・L-lTween20）,TKM液（50mmol・L-1Tris,pH;mol・L-lKC1;5mmol・L-lMgC12）,100g・L-1十二烷基磺酸钠（SDS）,4mol・L-lNaCl,无水乙醇，700mL・L-l乙醇，饱和酚氯仿，TE缓冲液（10mmol・L-lTrisHCL,pH;1mmol・L-lEDTA）.PCRRFLP试剂C677T引物Pl：5'

7、;TTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAG,P2：5GACTGGTAGCCCTGGATGGGAAAGATCCCG,A1298C引物P3：5'CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC,P4：5ZCACTTTGTGACCATTCCGGTTTG（上海生工合成）；4XdXTPs,MgC12,lOXBuffer,Taq酶（购自华丽）;限制性内切酶HinfI,MboII（日本TaKaRa公司）；25g・L-l琼脂糖和200mL・L-l聚丙烯酰胺、漠化乙锭.要紧仪器：PCR扩增仪（PE公司，480型）等.方式酚氯仿法提取DNA

8、采柠檬酸钠抗凝血2mL,用STE细胞裂解液使红细胞肿胀破裂，离心沉淀白细胞后，TKM重悬，依次加入SDS及NaCl破解白细胞，使蛋白析出，用饱和酚氯仿抽提广2次，取上清加冰无水乙醇使DA析出，12000g离心30s后以700mL・L-1乙醇洗去盐，晾干，最后用TE缓冲液(10：1)60UL溶解DNA.法检测基因型C677T：PCR反映体系25UL,含5nmol・L-l的引物，200UL・L-1的dNTPs,25mmol・L-lMgC12,10XBuffer,2UTaq聚合酶及100ng基因组DNA.反映条件

9、：955min-(9530s,6530s,7215s)X35-727min.扩增产物长度为173bp.限制性内切片段多态性分析(RFLP)：整体积10UL,加4UHinfI及lOXBuffer,37消化留宿，产物经25g・L-1琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观看电泳条带，分析其基因型.A1298C：PCR反映体系25UL,含5nmol・L-l的引物，200UL・L-1的dNTPs,25mmol・L-lMgC12,10XBuffer,2UTaq聚合酶及100ng基因组DNA.反映条件：955min一(9530s,

10、5530s,7215s)X35-727min.扩增产物长度为163bp.RFLP整体积10UL,加4UMboII及10XBuffer,37消化留宿，产物经200g・L-l聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳，浪化已锭染色后在紫外灯下观看结果，分析其基因型.2结果和MTHFRA1298C扩增结果和基因型分析MTHFRC677T扩增产物为173bp,被Hinfl酶切成128bp和45bp2条条带，依照此判定3种基因型，即纯合未突变CC,杂合CT和纯合突变TT型；MTHFRA1298C扩增产物为163bp,无突变发生时，能够被Mb。I【酶切成56,28,31,30和18bp5条条

11、带，突变后可产生84,31,30和18bp4条条带,据此将其基因型分为AA,AC,CC型.和MTHFRA1298c基因型的散布及其彼此关联关系（Tab1,2）其中677T等位基因在人群中的散布频率为45%,1298C等位基因在人群中的散布频率为20%,女性略低于男性，但不具有显著性不同.表1MTHFRC677T和MTHFRA1298C基因型的散布（略）TabIDistributionofMTHFRGenotypeinCaseandControls（略）表2c677T和Al298c基因型之间关系的散布（略）Tab2RelationshipbetweenMTHFRGenotypeinC677Tan

12、dA1298C（略）3讨论MTHFR基因在人群散布呈遗传多态性，并按孟德尔常染色体隐性方式遗传.欧洲人677T等位基因频率是24%-40%,日本人是26%-37%,非洲美洲人约11%,TT纯合子约占10%7；1298c等位基因在人群中的发生率约33%4,8.咱们在对96例汉族人进行基因分型后发觉，西安地域汉族人其677T等位基因频率为45%,TT纯合子占18%,女性水平稍低于男性（P>）.1298c等位基因占20%,纯合子仅发觉3例，均为男性，占总人数的3%.677T等位基因及突变纯合子TT频率高于日本人和非洲美洲人，但1298c等位基因频率却较文献报导低，提示这两个位点存在基因

13、多态性的群体变异，而且有可能和性别有必然的联系.VanderPutWeisberg4,6等以为突变等位基因677T和1298c在染色体上呈反式排列，即这两个突变等位基因一样情形下可不能同时存在于一条染色体上，并推测若是二者同时存在于一条染色体上，将对酶的活性产生较大阻碍.因此677和1298位点的突变具有明显的连锁不平稳性.咱们调查了96例仅发觉有1例呈677TT/1298AC这种双杂合子类型，占人群的1%,与文献报导相近6,也符合上述推测.本实验成立了快速抽提DXA的方式，应用PCRRFLP对MTHFR的两个SNP进行分析，可在两天内完成.此项方式不用放射性物质，只需凝胶染色即可直接观看到基

14、因型，幸免了耗资、耗时的杂交及测序技术，已成为分析MTHFR基因多态性的经常使用方式.利用这一技术可对人群进行MTHFR基因分型，为研究MTHFR基因多态性对北方汉族人的阻碍，成立数据库.同时为临床指导利用何种形式的叶酸增补剂来医治高同型半胱氨酸血症提供了依据.【参考文献】1MoyersS,BaileyLB.Fetalmalformationsandfolatemetabolism:ReviewofrecentevidenceReviewJ.NutrRev,2001;59(7):215-224.2BousheyCJ,BeresfordSA,OmennGS,MotulskyAG.Aquantit

15、ativeassessmentofplasmahomocysteineasariskfactorforvasculardisease:Probalebenefitsofincreasingfolicacidintakesj.JAMA,1995;274：1049-1057.1 DiazArrastiaR.HomocysteineandneurologicdiseaseJ.ArchNeurol,2000;57(10):1422-1429.4 VanderPutNM,GabreelsF,StevensEMB,SmeitinkJAM,TrijbelsFJM,EskesTKAB,vandenHeuvel

16、LP,BlomHJ.Asecondcommonmutationinthemethylenetetrahydrofolatereductasegene:AnadditionalriskfactorforNeuralTubedefectsj.AmJHumGenet,1998;62:1044-1051.5 GoyetteP,PaiA,MilosR,FrosstP,TranP,ChenZ,ChanM,RozenR.Genestructureofhumanandmousemethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)j.MammGenome,1998;9:652-65

17、6.6 WeisbergIS,JacquesPF,SelhubJ,BostomAG,ChenZ,CurtisEllisonR,EckfeldtJH,RozenR.The1298ACpolymorphisminmethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR):InvitroexpressionandassociationwithhomocysteineJ.Atherosclerosis,2001;156:409-415.7 PepeG,CamachoVanegas0,GiustiB,BrunelliT,MarcucciR,AttanasioM,Rickard0,DeStefanoGF,PriscoD,GensiniGF,AbbateR.Heterogeneityinworlddistrib